孫志博，馬中希，葉志偉，劉珍星，楊鐘華，張山鋒*

（1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院骨科，湖北武漢 430060；2.武漢市第四醫(yī)院、華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院骨科，湖北武漢 430034）

1 資料與方法

1.1 BMSCs分離

在獲得患者知情同意與醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)后，在2018年8月—2019年12月選取因GC-ON?FH行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的16例患者，GC-ONFH患者的納入標(biāo)準(zhǔn)為：服用糖皮質(zhì)激素≥1 800 mg，時間≥4周。其中8例男性，8例女性，年齡61～69歲，平均（64.35±5.17）歲；和16例股骨頸骨折患者，7例男性，9例女性，年齡59～73歲；平均（67.25±6.32）歲。術(shù)中抽取股骨骨髓5 ml，將其緩慢倒入含等體積淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，將離心獲得白膜層的單個核細(xì)胞置于另一離心管內(nèi)，用完全培養(yǎng)基懸浮并調(diào)整細(xì)胞密度，按一定密度接種，記作原代。每兩天換液，細(xì)胞達(dá)90%融合時消化，按1∶2比例傳代。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與基因轉(zhuǎn)染

實(shí)驗(yàn)分4組，每組5例：A組（GC-ONFH源BMSCs）、B組（GC-ONFH源BMSCs經(jīng)AID重組慢病毒轉(zhuǎn)染）、C組（GC-ONFH源BMSCs經(jīng)慢病毒空載體轉(zhuǎn)染）、D組（股骨頸骨折BMSCs）。取第3代細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染倍數(shù)（MOI=25 pfu）行病毒轉(zhuǎn)染，12 h后換液。以嘌呤霉素選擇培養(yǎng)基篩選，約2周后獲得抗性克隆細(xì)胞并大量擴(kuò)增。與此同時，C組行空載體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染倍數(shù)同前，D組行常規(guī)誘導(dǎo)。

1.3 檢測指標(biāo)與方法

1.3.1 MTT檢測

將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104/ml，接種至96孔板，每組各10孔，每孔加入完全培養(yǎng)基孵育過夜。在24、48、72 h的各個時間點(diǎn)分別每孔加入20 μl MTT溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)放置4 h后棄上清，加進(jìn)150 μl DMSO，酶聯(lián)免疫檢測儀記錄各孔吸光值。

1.3.2 線粒體膜電位檢測

線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential,MMP）檢測，在0.5 ml含有50萬細(xì)胞的細(xì)胞懸液內(nèi)，加入0.5 ml JC-1染色工作液，37℃孵育20 min。600 g 4℃離心10 min后棄上清。用JC-1染色緩沖液洗滌后，流式細(xì)胞儀測定相對熒光強(qiáng)度。

1.3.3 活性氧檢測

活性氧（reactive oxygen species,ROS）檢測，在離心后的細(xì)胞內(nèi)加入10 μM DCFH-DA，使細(xì)胞密度為5.0×106/ml。利用流式細(xì)胞儀檢測相對熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。

在檢測出發(fā)生周跳的歷元后，利用Chebyshev多項(xiàng)式擬合算法對周跳進(jìn)行修復(fù)。修復(fù)的具體過程為：先利用完好性監(jiān)測算法探測出發(fā)生周跳的歷元，然后利用Chebyshev多項(xiàng)式將附近沒有發(fā)生周跳的載波相位數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，計(jì)算出周跳的值。

1.3.4 亞硫酸氫鹽檢測

取 500 ng細(xì)胞 DNA，加雙蒸水到 20 μl，行PCR：98℃ 10 min，64℃ 2.5 h，DNA 行純化及脫硫。再次行PCR反應(yīng)。通過2%瓊脂糖凝膠電泳來鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。以DNA回收試劑盒回收產(chǎn)物并測序。測序區(qū)域?yàn)椋?760 bp～-407 bp，-328 bp～-55 bp。

1.3.5 Western blot檢測

收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液和PMSF，4℃12 000 r/min離心30 min，取上清。加入等體積的loading buffer，95℃孵育10 min后上樣電泳。以P糖蛋白或 AID一抗（1∶500）和 GAPDH（1∶1000）孵育過夜。次日以HRP標(biāo)記的二抗（1∶2000）于室溫孵育1 h后曝光顯像。

1.3.6 RT-qPCR檢測

提取各組細(xì)胞的總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄及熒光實(shí)時定量反應(yīng)，使用2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，重復(fù)3次。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示，資料呈正態(tài)分布時，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；資料非正態(tài)分布時，采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖檢測

MTT檢測結(jié)果見表2，隨時間推移，4組細(xì)胞MTT檢測的光密度（optimal density,OD）值均顯著增加（P＜0.05）。相應(yīng)時間點(diǎn)，D組的OD值明顯高于A、B、C組（P＜0.05），而B組OD值顯著高于A和C組（P＜0.05），但仍低于D組。A組與C組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 4組細(xì)胞MTT檢測OD值（±s）與比較

表2 4組細(xì)胞MTT檢測OD值（±s）與比較

時間點(diǎn)2 4 h A組（n=5）0.2 1±0.0 6 B組（n=5）0.2 6±0.0 4 C組（n=5）0.2 2±0.0 6 D組（n=5）0.3 2±0.0 5 P值＜0.0 0 1＜0.0 0 1 7 2 h P值0.3 3±0.0 6 0.0 1 3 0.4 2±0.1 1 0.0 1 5 0.3 2±0.0 7 0.0 4 1 0.4 5±0.0 9 0.0 2 2＜0.0 0 1

2.2 MMP檢測

MMP檢測結(jié)果見表3。D組線粒體膜電位明顯高于其他組（P＜0.05）。B組線粒體膜電位較A、C組明顯提高（P＜0.05），但仍低于D組。A、C組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05)。

表3 4組細(xì)胞線粒體膜電位、ROS和亞硫酸氫鹽檢測結(jié)果（±s）與比較

表3 4組細(xì)胞線粒體膜電位、ROS和亞硫酸氫鹽檢測結(jié)果（±s）與比較

2.3 ROS檢測

ROS結(jié)果見表3。D組的ROS水平顯著低于其他各組（P＜0.05）。B組的ROS水平較A、C組顯著降低（P＜0.05），但仍顯著高于 D 組（P＜0.05）。A、C組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05)。

2.4 亞硫酸氫鹽檢測甲基化率

亞硫酸氫鹽測序結(jié)果見表3。在選定的兩個甲基化島區(qū)域內(nèi)（-760 bp～-407 bp，-328 bp～-55 bp），D組ABCB1基因啟動子區(qū)甲基化率顯著低于A、C組（P＜0.05）。過表達(dá)AID后，B組ABCB1啟動子區(qū)甲基化率較A、C組明顯降低（P＜0.05），接近于D組水平（P＞0.05）。

2.5 Western blot檢測

Western blot檢測結(jié)果見圖1。4組圖像經(jīng)Image Pro Plus 6.0軟件檢測AID蛋白含量的OD值，A組為（0.24±0.03），B 組為（0.61±0.04），C 組為（0.22±0.03），D組為（0.79±0.05）。B組顯著高于A組及C組（P＜0.05），稍低于D組。

圖1 4組細(xì)胞AID及P-gp蛋白表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果。結(jié)果顯示B組的AID蛋白表達(dá)顯著高于A組及C組，稍低于D組。D組P糖蛋白表達(dá)顯著高于A、B、C 3組，B組P糖蛋白表達(dá)顯著高于A和C組，接近D組水平。這表明ONFH患者BMSCs中AID、P-gp表達(dá)顯著下調(diào)，AID過表達(dá)可明顯提高P糖的水平

P糖蛋白（P-glycoproteins,P-gp）蛋白含量的OD 值，A 組為（0.17±0.01），B 組為（0.46±0.04），C 組為（0.20±0.01），D 組為（0.54±0.04）。D 組 P-gp蛋白表達(dá)量顯著高于其他三組（P＜0.05），而B組P-gp蛋白表達(dá)量顯著高于A和C組（P＜0.05），接近D組水平。

2.6 RT-qPCR檢測

RT-qPCR檢測結(jié)果見表4。B組AID mRNA表達(dá)量顯著高于A組和C組，高達(dá)7倍（P＜0.05），接近D組水平（P＞0.05）。B組ABCB1 mRNA表達(dá)量顯著高于A組和C組（P＜0.05），但與D組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05)。

表4 四組細(xì)胞AID和ABCB1 mRNA表達(dá)RT-qPCR檢測結(jié)果（±s）與比較

表4 四組細(xì)胞AID和ABCB1 mRNA表達(dá)RT-qPCR檢測結(jié)果（±s）與比較

images/BZ_64_207_393_498_461.pngimages/BZ_64_498_393_847_461.pngimages/BZ_64_847_393_1266_461.pngimages/BZ_64_1266_393_1668_461.pngimages/BZ_64_1668_393_2016_461.pngimages/BZ_64_207_528_498_595.pngAID mRNA images/BZ_64_498_528_847_595.png1.0 0±0.1 0images/BZ_64_847_528_1266_595.png7.8 3±0.9 4images/BZ_64_1266_528_1668_595.png1.6 2±0.2 2images/BZ_64_1668_528_2016_595.png8.5 4±1.0 6 P值＜0.0 0 1＜0.0 0 1

3 討論

AID作為一種RNA編輯脫氨酶，參與了DNA/RNA編輯，B淋巴細(xì)胞免疫球蛋白基因的種類轉(zhuǎn)變重組和體細(xì)胞的超突變過程[1-3]。它通過將脫氧胞嘧啶轉(zhuǎn)化成脫氧尿嘧啶，修改靶基因序列從而促進(jìn)人體第二抗體的多樣化[7，8]。已知AID的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。近年來AID被發(fā)現(xiàn)具有很強(qiáng)的去甲基化功能[10]，它在體細(xì)胞DNA甲基化再編程及其多能性誘導(dǎo)和維持過程中起著十分重要的作用[11]。本課題組前期研究證實(shí)：表觀遺傳調(diào)控在激素性股骨頭壞死的發(fā)病過程中起著很重要作用[6]，ABCB1基因的過甲基化修飾，使得P糖蛋白合成減少，通過一系列生理生化過程導(dǎo)致BMSCs功能失調(diào)[5]。然而誘發(fā)激素性股骨頭壞死BMSCs基因組DNA過甲基化修飾的始動因素尚不清楚。為此，本研究通過對比AID在激素性股骨頭壞死組與對照組的表達(dá)水平，構(gòu)建AID重組慢病毒載體并轉(zhuǎn)染BM?SCs，觀察細(xì)胞的增殖能力、線粒體膜電位、細(xì)胞內(nèi)ROS水平及ABCB1基因啟動子區(qū)甲基化的動態(tài)變化，明確AID表達(dá)水平、ABCB1基因甲基化程度與BMSCs功能失調(diào)三者之間的關(guān)系，以期為該病的防治提供新的靶點(diǎn)。

作者通過實(shí)時定量PCR、Western blot、亞硫酸氫鹽測序等方法，在基因和蛋白質(zhì)水平上證實(shí)了激素性股骨頭壞死患者的BMSCs中AID、ABCB1表達(dá)顯著降低，ABCB1基因啟動子區(qū)甲基化水平增高；過表達(dá)AID能明顯地降低ABCB1基因甲基化水平，促進(jìn)ABCB1表達(dá)與細(xì)胞增殖，同時恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位及ROS水平，以上表明激素性股骨頭壞死疾病中AID表達(dá)受抑制，使得細(xì)胞處于過甲基化修飾狀態(tài)，抑制了ABCB1基因表達(dá)從而產(chǎn)生一系列病理生理改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能失調(diào)。

越來越多的研究表明，糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的BM?SCs氧化應(yīng)激損傷與激素性股骨頭壞死的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12-14]。高劑量的糖皮質(zhì)激素可誘發(fā)成骨細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)以及線粒體的功能變化[15，16]。處于嚴(yán)重的氧化應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)蓄積過量的活性氧會引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，線粒體DNA受損，線粒體功能失調(diào)，最終激活凋亡通路，誘發(fā)成骨細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致股骨頭壞死的發(fā)生[17]。有研究顯示抗氧化劑可通過降低細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平有效地防治激素性股骨頭壞死的發(fā)生發(fā)展[18，19]。因此，細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量及氧化應(yīng)激狀態(tài)在激素性股骨頭壞死的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，是治療上的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)中，作者發(fā)現(xiàn)過表達(dá)AID后細(xì)胞的增殖能力、線粒體膜電位水平、細(xì)胞內(nèi)活性氧水平均得到了顯著性恢復(fù)，這也提示AID可有效地抑制細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，改善細(xì)胞功能。通過上述結(jié)果，作者認(rèn)為AID可能通過降低基因組ABCB1基因的甲基化水平，提高其表達(dá)，促使P糖蛋白合成增多，從而將細(xì)胞內(nèi)蓄積的糖皮質(zhì)激素加快排出，降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，恢復(fù)細(xì)胞的正常生理功能。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了激素性股骨頭壞死患者BMSCs中AID表達(dá)顯著性下調(diào)，使得ABCB1呈過甲基化修飾狀態(tài)，抑制了P糖蛋白的合成與分泌；AID過表達(dá)能有效地降低其甲基化水平并改善細(xì)胞功能。本研究為激素性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制和臨床診治提供了新思路。