陳云,趙麗婷,顧正華,李由然,石貴陽,丁重陽*

1(糖化學與生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 2(糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 3(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

靈芝(Ganodermalucidum)是隸屬于擔子菌亞門、靈芝菌科、靈芝屬[1]的食藥用真菌。靈芝中含有蛋白質(zhì)、多糖、三萜等活性物質(zhì),多糖是其最主要的活性物質(zhì)之一,具有抗腫瘤、抗氧化和降血糖[2]等作用,可用于食品[3-4]和醫(yī)療[5-7]等多個行業(yè)。

靈芝多糖的合成過程與細菌類似,可總結為核苷酸糖(糖供體)的合成,糖鏈的連接和多糖的胞外輸出(涉及胞外多糖)。多糖合成途徑中的酶種類豐富,已有研究證明了糖供體合成途徑中的酶對多糖合成的調(diào)控作用。例如,過表達磷酸葡萄糖變位酶[8],可使靈芝胞內(nèi)外多糖產(chǎn)量分別提高9.1%和39.2%；此外,過表達半乳糖激酶和尿苷二磷酸(uridine diphosphate,UDP)-葡萄糖焦磷酸化酶[9],使蛹蟲草多糖產(chǎn)量分別提高了28.57%和21.43%。然而,關于食藥用真菌中參與糖鏈連接的糖基轉移酶研究報道較少。糖基轉移酶是多糖合成中的關鍵酶,負責許多結構復雜的化合物的生物合成[10],可催化糖供體和受體以特定的鍵連接。國內(nèi)外對細菌多糖合成中的糖基轉移酶的研究已較為成熟,細菌O-多糖生物合成的起始底物為GalNAc-PP-Und,李磊[11]經(jīng)化學合成該底物后,使用相關糖基轉移酶實現(xiàn)了“RU-PP-Und”的順序合成。LAMOTHE等[12]研究發(fā)現(xiàn),德氏乳桿菌的epsE基因編碼一種磷酸-葡萄糖基轉移酶,可啟動胞外多糖的生物合成。這些也為食藥用真菌中糖鏈合成的研究提供了參考。

盡管靈芝多糖合成中糖供體的合成途徑已較為清晰,但對于靈芝多糖合成中另一個重要環(huán)節(jié)——糖鏈連接的認識仍不清晰。本課題組通過對靈芝進行全基因組序列注釋和全基因組轉錄水平分析,挖掘得到了一系列參與糖鏈延伸的糖基轉移酶[13]。針對其中一個葡萄糖基轉移酶GL24971展開了進一步的研究,發(fā)現(xiàn)其功能為以UDP-葡萄糖為供體,催化葡聚糖鏈延伸。因此本研究以GL24971為研究對象,初步探究它對靈芝多糖合成的影響。通過該研究可進一步完善靈芝多糖的合成途徑,為針對大型真菌使用分子生物學手段提高多糖產(chǎn)量提供思路；同時也為探究靈芝多糖合成中其他的糖基轉移酶的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

靈芝菌株Ganodermalucidum5.26,中國普通微生物菌種保藏中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC);大腸桿菌BL21(DE3)、克隆質(zhì)粒PMD19T(Simple)、質(zhì)粒pAN7-1、質(zhì)粒p1300-1，本實驗室保存；實驗中所用的gpdi啟動子,Tsdh終止子均從靈芝基因組DNA克隆獲得。

靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：無氨基酵母氮源(yeast nitrogen base without amino acids,YNB)5.0,蛋白胨5.0,KH2PO44.5,MgSO4·7H2O 2.0,葡萄糖20.0；

CYM培養(yǎng)基：麥芽糖10.0 g/L,蛋白胨2.0 g/L,酵母粉2.0 g/L,KH2PO44.6 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,葡萄糖20.0 g/L,甘露醇0.6 mol/L；

絲狀真菌通用培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0,酵母粉5.0,KH2PO41.0,MgSO4·7H2O 1.0,維生素B10.1,葡萄糖20.0。

1.1.2 主要試劑和儀器

YNB、潮霉素、維生素B1,上海源葉生物科技有限公司；Biospin 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(無DNA殘留型),杭州博日科技股份有限公司；ClonExpress?MultiS One Step Cloning Kit、HiScript?Ⅲ 1 st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix,南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Nikon SMZ25顯微鏡,南京斯高譜儀器有限公司；TCS SP8激光共聚焦顯微鏡,德國徠卡公司；qTOWER3G實時熒光定量基因擴增儀,美國Bio-Rad公司；酶標儀,美國TECAN公司；GC-2030AF氣相色譜儀,日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 靈芝糖基轉移酶基因GL24971的擴增

提取靈芝的RNA并將其反轉錄為cDNA,以靈芝cDNA為模板,設計引物,擴增得到糖基轉移酶基因GL24971。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構建及轉化

為構建潮霉素表達盒gpdi-hmb-Tsdh,從質(zhì)粒pAN7-1上克隆得到潮霉素抗性基因hmb,將啟動子gpdi,潮霉素抗性表達框hmb及終止子Tsdh連接到質(zhì)粒PMD19T,獲得重組質(zhì)粒exp-Hmb。

為構建糖基轉移酶表達盒gpdi-GL24971-eGFP-CaMV,從質(zhì)粒p1300-1上克隆獲得增強型綠色熒光蛋白eGFP和終止子CaMV,將啟動子gpdi,基因GL24971,eGFP及終止子CaMV連接到在EcoR V單克隆位點線性化的質(zhì)粒exp-Hmb,獲得重組質(zhì)粒exp-GL24971-eGFP。

從斜面培養(yǎng)基中接種靈芝到靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中,于30 ℃,150 r/min條件下培養(yǎng)7 d后,轉接到新的靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中,25 ℃靜置培養(yǎng)4 d。

靈芝原生質(zhì)體的制備及其轉化參照文獻[14]進行。靜置培養(yǎng)后的靈芝菌絲轉入滅菌的50 mL離心管,4 ℃,6 500 r/min離心5 min,去上清液；加適量無菌水和0.6 mol/L甘露醇洗滌菌體,離心去上清液,余少量液體分裝至提前稱重5 mL離心管,每管用0.6 mol/L甘露醇補足3 mL,室溫,10 000 r/min離心10 min后去上清液,稱濕菌體質(zhì)量,加入溶壁酶與蝸牛酶,振蕩打散,置于30 ℃,150 r/min酶解2.5 h后過濾,濾液分裝在1.5 mL離心管中,4 ℃,3 500 r/min離心10 min去上清液,加入1 mL預冷的無菌PTC緩沖液,重懸沉淀,離心去上清液,吸取適量PTC緩沖液補足200 μL,重懸沉淀,取10 μL原生質(zhì)體用于顯微鏡觀察,余下原生質(zhì)體加入PTC緩沖液補足200 μL。取未加待轉化質(zhì)粒的原生質(zhì)體涂至未添加潮霉素的CYM固體平板用于復生,剩余的原生質(zhì)體用于轉化：加入10 μg待轉化質(zhì)粒,混勻,冰上靜置10 min；加入200 μL 聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)緩沖液,混勻,冰上靜置10 min,重復1次；最后加入800 μL PEG緩沖液,混勻,30 ℃培養(yǎng)箱中靜置30 min。室溫,4 000 r/min離心10 min,去上清液,加入1 mL的CYM液體培養(yǎng)基,混勻,25 ℃后培養(yǎng)2 d后涂至含80 mg/mL潮霉素的CYM固體平板。

1.2.3 轉化菌株的培養(yǎng)

將轉化平板上菌落接種到新的絲狀真菌通用培養(yǎng)基固體平板上,拍照記錄其生長狀況；挑取菌絲制片并使用激光共聚焦顯微鏡觀察菌絲中是否有綠色熒光。

將轉化菌株接種至靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中液體培養(yǎng),30 ℃,150 r/min培養(yǎng)14 d后,轉接至新的靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃,150 r/min培養(yǎng)5～8 d,發(fā)酵結束后離心獲得菌體,用去離子水沖洗3次后在真空冷凍干燥機中凍干,獲得干燥菌體,測定菌體干重作為其生物量,拍照記錄菌球形態(tài)。

1.2.4 相對轉錄水平分析

將液態(tài)發(fā)酵7 d的新鮮菌體用去離子水沖洗3次,擠干菌球內(nèi)水分,根據(jù)說明書提取靈芝RNA,將其反轉錄為cDNA后,經(jīng)實時熒光定量PCR檢測分析基因相對轉錄水平。

1.2.5 胞內(nèi)外多糖測定及單糖組分分析

胞外多糖測定：參照苯酚-硫酸法[15]。通過離心分離菌絲體和發(fā)酵液,取1 mL發(fā)酵液,加入3 mL無水乙醇,混勻后4 ℃過夜,10 000 r/min離心5 min,去上清液,用75%乙醇洗滌沉淀,去上清液,晾干殘留乙醇,加入4 mL水復溶沉淀,10 000 r/min離心5 min,取2 mL上清液液作為待測樣品。

胞內(nèi)多糖測定：將凍干后的菌體研磨成粉末,稱取20～30 mg凍干的菌體粉末,加入4 mL水,沸水煮3 h后10 000 r/min離心5 min,取1 mL上清液液加入3 mL無水乙醇,后續(xù)同胞外多糖測定方法。

單糖組分分析參照文獻[16]進行。離心分離菌絲體和發(fā)酵液,取適量發(fā)酵液加入3倍體積無水乙醇,混勻后4 ℃過夜,離心去上清液,沉淀用75%乙醇洗滌3次后,加適量去離子水復溶,液體凍干后得到胞外粗多糖；稱取適量菌粉后加水煮沸3 h,離心后獲得上清液,加入3倍體積無水乙醇,后續(xù)操作同胞外粗多糖,最后獲得胞內(nèi)粗多糖。取適量凍干的多糖加入2 mL 1 mol/L的硫酸,105 ℃水解8 h,冷卻后加BaCO3中和至中性,10 000 r/min離心10 min后取上清液,水洗沉淀2次,合并上清液,加1 mg肌醇作內(nèi)標,凍干后即為水解單糖；稱取凍干的水解單糖加20 mg/mL的溶于吡啶的鹽酸羥胺0.5 mL,90 ℃反應30 min,冷卻后加0.5 mL乙酸酐,90 ℃反應30 min,樣品冷卻后離心取上清液,送樣進行分析。

1.2.6 細胞壁組成成分測定

真菌細胞壁的主要成分為幾丁質(zhì)和β-葡聚糖[17],為分析過表達葡萄糖基轉移酶GL24971對細胞壁造成的影響,測定了這2種成分是否發(fā)生變化。

β-1,3-葡聚糖的測定參考苯胺藍熒光檢測法[18]。稱取40～50 mg凍干菌體,加2 mL 1 mol/L NaOH,52 ℃水浴30 min,10 000 r/min離心10 min,取0.5 mL上清液作為待測樣品,加入1.85 mL苯胺藍混合液,52 ℃水浴30 min,取樣品于405 nm、460 nm的條件下檢測其熒光值。β-1,3-葡聚糖含量表示為單位菌體的相對熒光百分比。

幾丁質(zhì)測定參考文獻[19-20]的方法。稱取40～50 mg凍干菌體,加入3 mL飽和KOH溶液,130 ℃反應1 h,冷卻后加入預冷的75%乙醇8 mL,振蕩懸浮,冰浴15 min；加入0.9 mL質(zhì)量分數(shù)為13.3% 硅藻土 54 s,振蕩懸浮,4 ℃,10 000 r/min離心5 min；使用10 mL預冷的40%乙醇和去離子水沖洗沉淀,離心去上清液,加入30 mL去離子水,混合均勻,取0.5 mL作為待測樣品。將0.5 mL水、5% NaNO2、5% KH2PO4加入0.5 mL樣品中,混勻,10 000 r/min離心10 min,取0.5 mL樣品,加入0.5 mL 質(zhì)量分數(shù)為12.5%的氨基磺酸銨,振蕩5 min；加入0.5 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙鹽酸鹽水合物,混合后沸水加熱3 min；冷卻后加入0.5 mL質(zhì)量分數(shù)為0.83%的FeCl3,室溫靜置30 min,檢測650 nm處的吸光值。

2 結果與分析

2.1 目的基因的擴增及重組質(zhì)粒的構建

以靈芝cDNA為模板,擴增得到葡萄糖基轉移酶基因GL24971,結果如圖1-a所示,基因片段GL24971的條帶位置與理論大小一致,為2 229 bp,圖1-b為重組過表達質(zhì)粒exp-GL24971-eGFP,可用于轉化至靈芝原生質(zhì)體。

a-GL24971基因擴增結果；b-重組質(zhì)粒圖譜M-DNA Marker;1-GL24971圖1 重組質(zhì)粒的構建Fig.1 Construction of recombinant plasmid

2.2 重組質(zhì)粒轉化至靈芝原生質(zhì)體

通過PEG轉化法,將構建成功的重組質(zhì)粒exp-GL24971-eGFP轉化至靈芝原生質(zhì)體,以未轉化重組質(zhì)粒的原生質(zhì)體為對照。原生質(zhì)體復生板和轉化板出現(xiàn)菌落(圖2-a),說明原生質(zhì)體制備成功；在激光共聚焦顯微鏡下觀察到轉化菌株的菌絲體中有綠色熒光(圖2-b),說明表達融合蛋白GL24971-eGFP的重組質(zhì)粒成功轉入原生質(zhì)體,且融合蛋白成功表達并分布于胞質(zhì)。挑取30株重組菌,接種于含有潮霉素的絲狀真菌通用培養(yǎng)基固體平板上傳代,挑選能夠穩(wěn)定遺傳的菌株,進行轉錄水平分析。

a-轉化菌株菌落狀態(tài):a1-原生質(zhì)體復生;a2-轉化板;b-熒光驗證：b1-明場;b2-熒光場;b3-疊加場圖2 重組質(zhì)粒轉化及融合蛋白表達Fig.2 Transformation of recombinant plasmid and expression of fusion protein

2.3 轉錄水平分析

將9株可穩(wěn)定遺傳的轉化菌株液態(tài)培養(yǎng)7 d后,收集新鮮樣品,提取靈芝RNA,以原始菌株為對照,測定葡萄糖基轉移酶GL24971的轉錄水平,結果如圖3所示,其中轉化菌株T1與T2的相對轉錄水平分別提高了124.5%與210.7%,因此后續(xù)實驗進一步針對這2株轉化子展開研究。

圖3 轉化菌株相對轉錄水平分析Fig.3 Analysis of relative transcription level注：不同的小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.4 轉化菌株的培養(yǎng)

將轉化菌株T1與T2在平板培養(yǎng)后拍照記錄其生長狀況。轉化菌株在無抗板上生長較快,在含抗生素的平板上的生長受到抑制。在含抗生素的平板中,T1與T2在培養(yǎng)到第7天時,T2可以觀察到明顯的菌絲生長,而T1此時還未觀察到菌絲(圖4-a～4-d),可能是T2轉錄水平高于T1,使得抗性能更快更多的積累,導致菌落生長情況產(chǎn)生差異。

T1與T2液體發(fā)酵5～8 d后測定其生物量和菌球形態(tài)。由圖4-e可知,T1與T2的最大生物量分別為3.31與4.16 mg/mL,相比于原始菌株在第8天時的生物量6.65 mg/mL,分別降低了50.2%與37.5%。觀察菌球形態(tài)發(fā)現(xiàn),原始菌株菌球形態(tài)不規(guī)則,呈絮狀且較松散,表面粗糙,而T1與T2菌球緊實,基本為球形且表面較光滑(圖4-f～4-h)。

a-T1(抗生素平板);b-T1(無抗平板);c-T2(抗生素平板);d-T2(無抗平板);e-菌株生物量;f-原始菌株形態(tài);g-轉化菌株T1形態(tài);h-轉化菌株T2形態(tài)圖4 轉化菌株生長情況Fig.4 Growth of transformed strains

2.5 胞內(nèi)外多糖及單糖組分測定

轉化菌株發(fā)酵到第5天時開始測定胞內(nèi)外多糖產(chǎn)量。結果顯示,T1與T2的單位菌體胞外多糖最大產(chǎn)量分別為0.07與0.06 mg/mg(圖5-a),分別提高了132.4%與70.0%,胞內(nèi)多糖產(chǎn)量均為0.03 mg/mg,分別降低了10.7%與37.4%(圖5-b)。

a-胞外多糖;b-胞內(nèi)多糖圖5 多糖產(chǎn)量Fig.5 Production of polysaccharides

為分析過表達GL24971對多糖中單糖組分的影響,測定了胞內(nèi)外粗多糖的單糖組分。表1顯示,原始菌株的胞外多糖組分中含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖,而T1與T2菌株的胞外多糖組分中葡萄糖的比例提高,且?guī)缀跷礄z測到半乳糖的存在。胞內(nèi)多糖單糖組成結果顯示(表2),在原始菌株和轉化菌株的胞內(nèi)多糖組分中均檢測到木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖,其中木糖所占比例較小,且轉化菌株中半乳糖含量明顯降低。葡萄糖基轉移酶基因GL24971的過表達使得大量UDP-葡萄糖被合成和利用,因此多糖中葡萄糖的比例得到提高。同時,根據(jù)糖供體合成途徑可知,UDP-葡萄糖可在UDP-葡萄糖4-差向異構酶的作用下被轉化為UDP-半乳糖,由于UDP-葡萄糖被葡萄糖基轉移酶GL24971大量消耗,使得其流向UDP-半乳糖合成的量減少,從而導致胞內(nèi)外多糖中半乳糖組分的比例出現(xiàn)下降。

表1 胞外多糖中的單糖組成 單位：%(摩爾百分比)

表2 胞內(nèi)多糖單中的糖組成 單位：%(摩爾百分比)

2.6 細胞壁成分分析

幾丁質(zhì)和葡聚糖為靈芝細胞壁的主要成分,為分析靈芝細胞壁成分的變化,菌體中幾丁質(zhì)和β-1,3-葡聚糖含量測定結果見圖6。菌株T1和T2的幾丁質(zhì)和β-1,3-葡聚糖含量均下降。β-葡聚糖作為真菌細胞壁外層的主要成分,在細胞壁的外部結構中起著重要作用,幾丁質(zhì)具有很高的抗張強度,有助于細胞壁的完整性[21]；幾丁質(zhì)和β-1,3-葡聚糖含量的降低會對細胞壁的完整性造成損害[22]。因此,轉化菌株的幾丁質(zhì)與β-1,3-葡聚糖含量的降低,影響了細胞壁的完整性,促進多糖分泌至胞外,從而提高了單位菌體胞外多糖的含量。

a-幾丁質(zhì);b-β-1,3-葡聚糖圖6 細胞壁成分含量Fig.6 Content of cell wall components

3 結論與討論

在課題組前期對靈芝的全基因組序列注釋和全基因組轉錄水平分析中,發(fā)現(xiàn)了轉錄水平上調(diào)的基因GL24971,該基因編碼葡萄糖基轉移酶。在靈芝中過表達該基因后,轉化菌株的生物量降低了37.5%,為4.16 mg/mL；單位菌體胞外多糖最大產(chǎn)量可達到0.07 mg/mg,提高了132.4%；胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為0.03 mg/mg,降低了10.7%；在分析單糖組分后發(fā)現(xiàn),過表達菌株的胞外多糖中葡萄糖比例提高且半乳糖比例基本降低到無法檢出,胞內(nèi)多糖中半乳糖比例顯著降低,葡萄糖基轉移酶GL24971的過表達使得大量UDP-葡萄糖被合成和利用,因此多糖中葡萄糖的比例得到提高。同時,根據(jù)糖供體合成途徑可知,UDP-葡萄糖可在UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的作用下轉化為UDP-半乳糖,由于UDP-葡萄糖被葡萄糖基轉移酶GL24971大量消耗,使得其流向UDP-半乳糖合成的量減少,從而導致胞內(nèi)外多糖中半乳糖組分的比例出現(xiàn)下降；過表達菌株細胞壁中幾丁質(zhì)含量和β-1,3-葡聚糖的含量均下降,可能導致細胞壁的完整性受到損害,促使多糖更多地分泌至胞外,從而提高了單位菌體胞外多糖的產(chǎn)量。這些研究結果表明葡萄糖基轉移酶GL24971在多糖合成和細胞形態(tài)方面都具有重要的影響,這進一步完善了靈芝多糖復雜的合成途徑,也為后續(xù)研究靈芝中的糖基轉移酶提供了參考。