黃和強(qiáng),車富紅,陳占秀,祁萬軍,孔令武,李善文,馮聲寶*

1(中國青稞酒研究院,青海 互助,810500) 2(青?；ブ囡乒煞萦邢薰?青海 互助,810500)

大曲是中國傳統(tǒng)白酒釀造中特有的關(guān)鍵糖化發(fā)酵劑,主要包括菌系、酶系和物系,菌系和酶系是生成乙醇和復(fù)雜風(fēng)味化合物產(chǎn)生的必要條件,物系為釀酒提供部分發(fā)酵原料和風(fēng)味形成的前體物質(zhì)[1],它們質(zhì)量的好壞直接決定著酒的產(chǎn)率和品質(zhì),素有“曲為酒之骨”之說[2]。青稞酒以青稞為原料,中低溫青稞大曲為糖化發(fā)酵劑,采用固態(tài)發(fā)酵和固態(tài)蒸餾取酒,是中國白酒釀造中唯一采用曲糧合一的傳統(tǒng)工藝,具有清蒸清燒四次清、花崗巖窖池發(fā)酵的工藝特點(diǎn)。

大曲的制作是開放式的混菌發(fā)酵,在自然發(fā)酵過程中富集了環(huán)境中的大量微生物,微生物群落結(jié)構(gòu)及其演變對于大曲制作的過程條件把控和最終曲的質(zhì)量具有重要作用。王鵬等[3]根據(jù)風(fēng)味貢獻(xiàn)程度、相互作用關(guān)系強(qiáng)度和相對豐度確定Lactobacillus、Saccharomyces、Candida、Rhizopus、Saccharomycopsis、Pichia、Dipodascus、Bacillus、Thermoascus和Lactococcus等 10 個(gè)屬為濃香型白酒發(fā)酵過程的核心微生物群。WANG 等[4]借助高通量擴(kuò)增子測序解析濃香型白酒酒醅、大曲和窖泥原核微生物群落結(jié)構(gòu)差異,判定發(fā)酵酒醅微生物主要來源。同時(shí),大曲原料的配比、質(zhì)量的優(yōu)劣以及不同的工藝技術(shù)方法,對大曲的類別和質(zhì)量有很大的影響。目前對于青稞酒的研究主要集中在釀造微生物及原酒風(fēng)味組分[5],對青稞大曲制作過程中微生物菌群結(jié)構(gòu)及其群落演變并不太清楚,解析青稞大曲制做過程中微生物群落演替規(guī)律,判定制曲過程中核心功能微生物及其驅(qū)動(dòng)因子對于今后提升青稞大曲的質(zhì)量至關(guān)重要。王鵬[6]研究了濃香型白酒酒醅發(fā)酵過程中的核心微生物,通過核心功能微生物的強(qiáng)化應(yīng)用,提升了白酒釀造品質(zhì)的控制。本文通過高通量擴(kuò)增子測序解析3種不同配料大曲發(fā)酵過程中的微生物群落結(jié)構(gòu),采用氣質(zhì)聯(lián)用測定大曲發(fā)酵過程中不同時(shí)間點(diǎn)樣品中的重要風(fēng)味化合物,并使用多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)酵過程中微生物菌群結(jié)構(gòu)及群落演替與主要代謝物質(zhì)之間的網(wǎng)絡(luò)共線性關(guān)系,找出大曲發(fā)酵過程中的優(yōu)勢微生物種群,為后期青稞大曲功能微生物的篩選及強(qiáng)化大曲品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

實(shí)驗(yàn)樣品取自某青稞酒廠兩種不同配料大曲,分別在制曲過程第 0、2、3、4、5、8、12、15和30 d(出房)取樣,于-20 ℃冰箱保藏備用。

1.2 試驗(yàn)試劑和儀器

1.2.1 主要試劑

NaH2PO4、Na2HPO4、NaOH、NaCl,國藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑有限公司；異戊醇氯仿、乙酸鈉、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl snlfate,SPS)、飽和苯酚溶液,生工生物工程(上海)股份有限公司。

0.1 mm玻璃珠、0.5 cm玻璃珠,Sigma公司。

1.2.2 溶液配制

0.1 mol/L PBS緩沖液：0.05 mol/L Na2HPO4、0.042 3 mol/L NaH2PO4(精確稱取8.19 g Na2HPO4和5.075 g NaH2PO4,加入去離子水定容至1 L,121 ℃高壓滅菌15 min,保存?zhèn)溆?。

Buffer Z溶液：10 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl(母液1 mol/L的Tris-HCl,精確稱取12.1 g Tris加入到80 mL去離子水中,再加入4.2 mL濃鹽酸,定容至100 mL,pH 8.0,121 ℃高壓滅菌15 min保存?zhèn)溆?。

100 g/L SDS溶液：精確稱取10 g SDS溶于去離子水中,定容至100 mL,121 ℃高壓滅菌15 min備用。

1.2.3 主要儀器

電子天平,Mettler-Toledo 公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī),德國Eppendorf公司,Milli-Q 超純水系統(tǒng),美國Millipore 公司；607EUR珠磨儀,美國Biospec Products公司；Nano Drop—1000紫外可見分光光度計(jì),核酸濃度檢測儀,美國賽默飛科技公司；GC6890 N-MSD5975氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大曲和酒醅理化指標(biāo)的測定

大曲和酒醅的水分、酸度、淀粉含量、糖化酶、淀粉酶和酯化酶等理化指標(biāo)均依據(jù)QB/T 4257—2011 方法測定,所有分析均以干重計(jì)。大曲溫度采用溫度計(jì)實(shí)時(shí)測定。酒醅溫度使用溫度計(jì)插入窖池1.2 m深處測定。

1.3.2 樣品中揮發(fā)性化合物含量的檢測

1.3.2.1 樣品的預(yù)處理

取5.000 g待測樣品,置于50 mL離心管中,加入去離子水20 mL,振蕩1 min混勻,冰浴超聲波30 min,再振蕩1 min,8 000 r/min離心5 min,取8 mL上清液置于裝有3 g NaCl的頂空瓶中。

1.3.2.2 GC-MS檢測

揮發(fā)性化合物的測定采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；Agilent 6890 N氣相色譜儀和Agilent 5975質(zhì)譜檢測器,色譜柱為DB-Wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm；J&W Scientific),內(nèi)標(biāo)為分析級薄荷醇(106.25 mg/L),檢測條件參考文獻(xiàn)[7]。

1.3.3 樣本DNA 提取、PCR擴(kuò)增和高通量測序

稱取7 g酒醅樣品,參照李小龍[8]等的方法提取樣品中的DNA。細(xì)菌用16S的V3-V4區(qū)引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進(jìn)行擴(kuò)增；對于真菌,用ITS2區(qū)引物ITS3(5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增[8]。PCR 細(xì)菌擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)熱5 min,95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s；72 ℃延伸40 s,共25個(gè)循環(huán),最后72 ℃ 保持10 min。真菌擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)熱2 min,95 ℃變性30 s,61 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共32個(gè)循環(huán),最后72 ℃保持10 min。PCR產(chǎn)物根據(jù)已有的報(bào)道方法進(jìn)行純化[9]。純化后的產(chǎn)物用Nanodrop ND-1000 UV-Vis 定量,然后將PCR 產(chǎn)物等分子量混合,并根據(jù)Low Sample Protocol進(jìn)行文庫的制備,最后在 2×300 Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行雙端測序。

1.3.4 序列處理分析

對測序下機(jī)的原始序列進(jìn)行去除標(biāo)簽、引物和接頭序列及去除嵌合體等處理。然后把高質(zhì)量的序列根據(jù)97%的序列相似度聚成不同的操作性分類單元(operational taxonomic unit,OTU)[8,10],并計(jì)算Chao1、shannon多樣性指數(shù)[11]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 主成分分析

根據(jù)高通量擴(kuò)增子測序數(shù)據(jù),統(tǒng)計(jì)不同取樣點(diǎn)微生物屬的相對豐度,借助SPSS 19.0進(jìn)行主成分分析,揭示大曲制作和酒醅發(fā)酵過程中微生物群落的演替軌跡。

1.4.2 冗余分析

通過R語言的Vegan包計(jì)算制曲過程中環(huán)境因子和微生物群落之間的關(guān)系,分析環(huán)境因子對群落結(jié)構(gòu)的影響,并進(jìn)行蒙特卡洛置換檢驗(yàn)[12]。

1.4.3 網(wǎng)絡(luò)圖繪制

用SPSS軟件計(jì)算微生物與代謝物之間的Pearson相關(guān)系數(shù),找出相關(guān)系數(shù)顯著并且大于0.5的作為可視化對象[13]。使用Gephi軟件對大曲發(fā)酵過程中微生物和代謝物之間的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行可視化,判定與制曲過程中的核心微生物[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 制曲過程微生物多樣性及菌群結(jié)構(gòu)

采用MiSeq 測序技術(shù)確定2種配料大曲制作過程中的微生物群落組成。通過質(zhì)控后,細(xì)菌得到1 064 488條高質(zhì)量的序列,平均每個(gè)樣本有(53 339±6 000)條；獲得6 735個(gè)OTUs,每個(gè)樣品得到(374±105)個(gè)OTUs。真菌質(zhì)控后共得到1 277 271條高質(zhì)量的序列,平均每個(gè)樣本具有(70 959±29 131)條；獲得4 665個(gè)OTUs,每個(gè)樣品得到(259±45)個(gè)OTUs。各樣品的覆蓋率均在99%以上,說明樣本測序深度和數(shù)據(jù)質(zhì)量足夠可靠[15]。

比較了2種不同配料方案大曲發(fā)酵過程中微生物Chao1和Shannon指數(shù),如圖1所示,方案一[m(青稞)∶m(豌豆)=7∶3]大曲中原核微生物群落的Chao1和Shannon指數(shù)要低于方案二[m(青稞)∶m(豌豆) ∶m(小麥)= 5∶3∶2],2種方案大曲中真菌Chao1和Shannon指數(shù)沒有明顯的差異,表明2種不同方案細(xì)菌微生物多樣性差異顯著,真菌物種多樣性沒有明顯的差異。

a-細(xì)菌Chao1指數(shù)；b-細(xì)菌Shannon指數(shù)；c-真菌Chaol指數(shù)；d-真菌Shannon 指數(shù)圖1 不同配料大曲微生物組成多樣性分析Fig.1 Diversity analysis of microbial composition of Daqu with different ingredients注：方案一-m(青稞)∶m(豌豆)=7∶3；方案二-m(青稞)∶m(豌豆)∶m(小麥)=5∶3∶2 (下同)

基于OTU相對豐度的主成分分析表明(圖2),方案一和方案二在前期(0和5)細(xì)菌和真菌群落都較為相似,而從發(fā)酵第5天開始,2種方案細(xì)菌群落演替軌跡比較相似,真菌群落演替出現(xiàn)明顯的分化。

a-細(xì)菌;b-真菌圖2 不同配料大曲制作過程中基于OTU水平的微生物群落的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of microbial community based on OTU level during the production of Daqu with different ingredients

利用高通量測序解析了不同配料大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)和組分,圖3為2種不同配料方案大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)和組分圖(OTU≥0.1%)。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),真菌群落中0～4 d主要由Saccharomycopsis、Alternaria、Cladosporium主導(dǎo),從第4天開始一直到出房,Saccharomycopsis逐漸占據(jù)優(yōu)勢,同時(shí)Pichia和Wickerhamomyces具有一定的優(yōu)勢。對于細(xì)菌,在整個(gè)過程中Pantoea占到絕對的優(yōu)勢,Staphylococcus也具有很高的優(yōu)勢,在2個(gè)方案中占比沒有明顯差異?？偟膩碚f,青稞大曲制作過程中真菌Pichia、Saccharomyces具有較高的優(yōu)勢,Lactobacillus在發(fā)酵前期所占比例上升平穩(wěn),在發(fā)酵后期在酒醅中占主要地位。在整個(gè)發(fā)酵過程中,方案二的真菌結(jié)構(gòu)在后期發(fā)生了明顯變化,Issatchenkia比方案一又說增加；在細(xì)菌組成上,方案二在發(fā)酵后期Lactobacillus的豐度比方案一高,說明小麥的加入引起了方案二菌群結(jié)構(gòu)的變化。生產(chǎn)實(shí)際表明方案二大曲質(zhì)量總體評價(jià)好于方案一大曲,說明一定量小麥的加入影響了大曲微生物群落結(jié)構(gòu)和演替,微生物組成變化是造成大曲質(zhì)量差異的主要原因。

a-細(xì)菌;b-真菌圖3 大曲在屬水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Distribution of microbial community at the genus level in Daqu during fermentation

2.2 制曲過程代謝物質(zhì)變化

在制曲過程中,方案一分析出風(fēng)味物質(zhì)有104種,包括35種醇類、6 種酸類、14種酯類、4種吡嗪類化合物；方案二130種,包括38種醇類、11種酸類、25種酯類、7種吡嗪類化合物(圖4)。整體上方案一風(fēng)味物質(zhì)總種類低于方案二,2種方案酯類物質(zhì)的種類較豐富。通過化合物的相對含量的聚類分析可看出(圖5),大曲中醇類、醛類、酚類在出房時(shí)含量較高,醇類占60%～80%,酸類在培養(yǎng)至第4天時(shí)含量最高,后期降低明顯。酯類含量也較高,培養(yǎng)前期占10%左右,4～15 d時(shí)降低,第21 天時(shí)又增加明顯,達(dá)到最高值。

a-方案一;b-方案二圖4 大曲培養(yǎng)風(fēng)味物質(zhì)種類Fig.4 Types of flavor substances in Daqu culture

2.3 制曲過程核心微生物判定

選取在制曲過程中豐度在前15的細(xì)菌屬和前 15的真菌屬,計(jì)算這30個(gè)屬與61種代謝物之間的Pearson 相關(guān)系數(shù)(R),選取R>0.5 作為有效的網(wǎng)絡(luò)連接并繪圖(圖6)?？梢园l(fā)現(xiàn),細(xì)菌與代謝產(chǎn)物的連接數(shù)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于真菌,與細(xì)菌相關(guān)的主要化合物是乙醛(V18、V19、V20、V21、V22)；與真菌相關(guān)的化合物主要有醇、酸、酯和吡嗪類,細(xì)菌屬Acinetobacter、Olivibacter只和吡嗪類化合作的有顯著的相關(guān)性；另外,真菌與酮類化合物的相關(guān)性較強(qiáng),其中絕大多數(shù)細(xì)菌與1-辛烯-3-酮(V27)和傘花烴(V17)有顯著的相關(guān)性；Lactobacillus、Pediococcus、Saccharomycopsis與醇、酸、酯都有顯著的相關(guān)性,Wickerhamomyces、Aureobasidium與醇、酯、吡嗪有一定的相關(guān)性。以上結(jié)果表明,在大曲發(fā)酵過程中與重要的代謝產(chǎn)物相關(guān)的細(xì)菌有Lactobacillus、Leuconostoc、Pediococcus,真菌有Saccharomycopsis、Pediococcus、Wickerhamomyces和Aureobasidium,其中Acinetobacter、Olivibacter和Meyerozyma對吡嗪的貢獻(xiàn)較大。

圖6 微生物與代謝產(chǎn)物網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Network of microorganisms and metabolites

2.4 環(huán)境因子對制曲微生物的影響

環(huán)境因素會(huì)影響微生物的組成和分布,通過冗余分析解析了微生物與青稞大曲制作過程關(guān)鍵環(huán)境因子之間的關(guān)系(圖7),在制曲過程中與糖化和液化相關(guān)的微生物有Wickerhamomyces、Rhizopus、Aspergillus、Hypocreales、Ralstonia、Bacteria、Burkholderia、Bacillus；與產(chǎn)酸有關(guān)的微生物主要有Lactobacillales、Leuconostoc、Pediococcus、Lactobacillaceae、Lactobacillus、Enterobacteriaceae、Saccharomycetales；與氨態(tài)氮相關(guān)的微生物主要有Penicillium、Aspergillaceae、Microbotryomycetes、Fusarium、Acinetobacter、Bacillus。蒙特卡洛置換檢驗(yàn)的結(jié)果表明(表1),釀造過程中溫度、酸度和乙醇是影響不同季節(jié)中微生物群落組成差異的重要原因。

圖7 環(huán)境因子與大曲微生物之間的相關(guān)性Fig.7 Correlation between environmental factors and Daqu microorganisms

理化因子對制曲過程群落分布的解釋率為37.86%,游離氨態(tài)氮對微生物群的分布具有極顯著相關(guān)性(r2>0.5,P<0.001),說明環(huán)境中的氮對微生物群落結(jié)構(gòu)演替有重要的推動(dòng)作用。環(huán)境因子變化與大曲微生物群落衍變有顯著地相關(guān)性,隨著原料中小麥含量增加,氨態(tài)氮含量變化會(huì)驅(qū)動(dòng)大曲中微生物群落衍變。

表1 微生物群與環(huán)境因子之間的蒙特卡洛置換檢驗(yàn)結(jié)果Table 1 Monte-Carlo permutation test of the core microbiota with environmental factors.

3 結(jié)論

2種不同配料大曲在制曲過程中真菌微生物菌群結(jié)構(gòu)存在差異性,方案二大曲中Lactobacillus和Issatchenkia的含量要高于方案一。初步確定青稞大曲的優(yōu)勢微生物屬細(xì)菌為Pantoea、Staphylococcus,真菌包括Pichia、Saccharomycopsis。通過微生物與代謝產(chǎn)物網(wǎng)絡(luò)可視化分析,初步判定在大曲發(fā)酵過程中與重要的代謝產(chǎn)物相關(guān)的微生物有Lactobacillus、Leuconostoc、Pediococcus、Saccharomycopsis、Pediococcus、Wickerhamomyces、Aureobasidium。制曲過程中與糖化和液化相關(guān)的微生物有Wickerhamomyces、Rhizopus、Aspergillus、Hypocreales、Ralstonia、Bacteria、Burkholderia、Bacillus；與產(chǎn)酸有關(guān)的微生物主要有Lactobacillales、Leuconostoc、Pediococcus、Lactobacillaceae、Lactobacillus、Enterobacteriaceae和Saccharomycetales；與氨態(tài)氮相關(guān)的微生物主要有Penicillium、Aspergillaceae、Microbotryomycetes、Fusarium和Acinetobacter、Bacillus。這些菌很可能是青稞大曲制作過程中的核心微生物。在大曲制備過程中游離氨態(tài)氮對微生物群的分布具有極顯著相關(guān)性,隨著原料中小麥含量增加,氨態(tài)氮含量變化會(huì)驅(qū)動(dòng)大曲中微生物群落衍變。

本研究借助高通量測序方法解析了青稞大曲制作過程中微生物群落結(jié)構(gòu)和演替規(guī)律,初步判定了制曲過程中的核心微生物屬。同時(shí)分析了青稞大曲配料中適量加入小麥對大曲微生物菌群結(jié)構(gòu)和大曲質(zhì)量的影響。但本研究只通過高通量測序解析了微生物群落結(jié)構(gòu),初步判定了制曲過程中的優(yōu)勢微生物屬,后續(xù)還需要結(jié)合釀酒過程中酒醅微生物變化,明晰大曲微生物對酒醅釀造微生物的貢獻(xiàn),為今后功能菌的篩選及強(qiáng)化大曲提供科學(xué)依據(jù)。