宋俊喬 孫海潮 張曉輝 盧道文 牛永鋒 張瑩瑩 張 盼 董文恒 李永江

（安陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 河南安陽(yáng)455000）

玉米是世界三大糧食作物之一，種植范圍最廣，其產(chǎn)量最大。 追求產(chǎn)量的增加仍是我國(guó)玉米育種重要任務(wù)之一， 利用雜種優(yōu)勢(shì)是玉米育種的最主要手段[1]。 縱觀玉米育種進(jìn)程，對(duì)于玉米育種方式方法的改進(jìn)也是伴隨玉米種質(zhì)改良過(guò)程不可或缺的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。 對(duì)于傳統(tǒng)的育種方式，一個(gè)新品種的選育和審定至少需要10 年的時(shí)間，為了提高育種效率我們選擇了分子標(biāo)記輔助育種的技術(shù)， 只有分子標(biāo)記初篩后具有目標(biāo)性狀的材料才會(huì)進(jìn)入下一個(gè)育種環(huán)節(jié)，縮小了試驗(yàn)地的使用，提高了育種效率，使遺傳增益（genetic gains）更加具有方向性，更加清晰。自從Randolph 和 Stadler 在 1929 年第一次報(bào)道了玉米單倍體[2]，玉米育種家對(duì)于單倍體育種方法的探索和改進(jìn)就再也沒(méi)有停止過(guò)。 玉米單倍體育種主要包括：?jiǎn)伪扼w誘導(dǎo)、鑒定和加倍三個(gè)環(huán)節(jié)，上篇文章已經(jīng)對(duì)誘導(dǎo)和鑒定兩個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行了詳細(xì)闡釋， 本篇文章會(huì)對(duì)單倍體加倍的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行有效的探討。

1 單倍體加倍方法

選育出來(lái)的單倍體育種材料，含有一套染色體，因此單倍體的植株生長(zhǎng)一般比較弱小， 葉片短而窄小，并且高度不育，不能直接應(yīng)用于玉米遺傳育種，只有經(jīng)過(guò)加倍， 形成正常的雙單倍體才能應(yīng)用在育種和生產(chǎn)中。 目前單倍體加倍的方法一般有自然加倍與人工加倍。

1.1 自然加倍

單倍體植株在自然生長(zhǎng)條件下， 不經(jīng)過(guò)人為處理自發(fā)產(chǎn)生二倍體種子的過(guò)程，稱為自然加倍。 單倍體在自然條件下進(jìn)行自發(fā)加倍形成二倍體的概率比較低， 但是因?yàn)槿斯ぜ颖兜姆椒ㄖ兄饕捎玫那锼伤貙?duì)人和環(huán)境都有危害， 所以育種學(xué)家又把精力轉(zhuǎn)移到單倍體自然加倍的遺傳改良上來(lái)。 單倍體的二倍化主要表現(xiàn)在雌穗結(jié)實(shí)性與雄穗的散粉性，任嬌嬌[3]等發(fā)現(xiàn)在單倍體育性恢復(fù)的過(guò)程中，雌穗與雄穗的育性恢復(fù)是2 個(gè)互相獨(dú)立的過(guò)程， 因此在遺傳研究中要加以區(qū)分對(duì)待。

1.1.1 雄穗育性恢復(fù) Chase[4]研究表明，玉米單倍體可以產(chǎn)生自交結(jié)實(shí)，Khoklov 等[5]發(fā)現(xiàn)單倍體在沒(méi)有經(jīng)過(guò)物理或者化學(xué)因素處理下， 二倍體細(xì)胞也是存在于單倍體植株中，并認(rèn)為這是自然加倍的結(jié)果。 吳鵬昊[15]認(rèn)為在自然條件下，單倍體的自然加倍能力主要受限于雄穗的散粉性能， 不同遺傳背景下的單倍體也存在不同程度的育性恢復(fù)， 有的是單個(gè)小穗或者幾個(gè)小穗可以散粉，還有的達(dá)到整穗散粉，楊繼偉等[6]認(rèn)為這有可能和單倍體細(xì)胞的二倍化早晚程度有關(guān)系。 Chase[7]和魏俊杰等[8]對(duì)單倍體雄穗的自然恢復(fù)進(jìn)行的研究結(jié)果表明， 如果自然恢復(fù)率達(dá)到10%左右， 不同基因型的變異系數(shù)可以達(dá)到50%。Shatskaya 等[9]研究也認(rèn)為，單倍體雄穗的可育性程度也是遺傳性狀之一，不同來(lái)源的基因型單倍體雄穗，其育性恢復(fù)能力差異表現(xiàn)也很大。

1.1.2 雌穗育性恢復(fù) 劉志增等[10]也進(jìn)行了自然恢復(fù)的相關(guān)研究， 單倍體雌穗的育性自然恢復(fù)率都可以達(dá)到 90% 以上。 Chalyk[11]利用馬齒型玉米的234 個(gè)單倍體植株， 混合正常的二倍體花粉進(jìn)行雜交和授粉，結(jié)實(shí)的果穗最高有127 粒，平均每一個(gè)果穗可以結(jié)實(shí) 26.6 個(gè)，只有 8 個(gè)果穗沒(méi)有結(jié)實(shí)。任姣姣[12]用鄭單 958 花粉對(duì)來(lái)源不同的 22 個(gè)自交系單倍體雌穗進(jìn)行多次授粉， 由此來(lái)分析單倍體雌穗的育性恢復(fù)能力，研究結(jié)果表明，單倍體雌穗的平均結(jié)實(shí)株率可以達(dá)到 89.54%。 由此可見(jiàn)， 單倍體雌穗自然恢復(fù)為二倍化的能力高于雄穗。 多項(xiàng)研究結(jié)果表明，單倍體雌穗的育性自然恢復(fù)能力決不是限制單倍體自然加倍的主要因素。

1.1.3 育性恢復(fù)的分子研究 吳鵬昊研究結(jié)果表明在自然條件下， 生殖細(xì)胞與體細(xì)胞存在倍性轉(zhuǎn)化現(xiàn)象[13]，但是雌穗結(jié)實(shí)率較高，單倍體的二倍化主要表現(xiàn)在雌穗結(jié)實(shí)性與雄穗的散粉性， 單倍體自然加倍能力受限于雄穗散粉的性能，這與Chalyk[14]的研究結(jié)果基本相同。 育種家認(rèn)為玉米單倍體的雄穗育性恢復(fù)能力和遺傳因素有著顯著相關(guān)性。 深入進(jìn)行單倍體雄穗育性恢復(fù)的遺傳研究， 控制單倍體雄穗的育性恢復(fù)主效QTL 是提高單倍體進(jìn)行自然加倍效率的關(guān)鍵因素之一。 吳鵬昊[15]利用Fm 群體對(duì)單倍體雄穗的育性恢復(fù)性狀進(jìn)行定位， 檢測(cè)到有六個(gè)位點(diǎn)分別位于 1，3，6，9，10 號(hào)的染色體上。 由于雙親在雄穗的育性恢復(fù)性狀上差異相對(duì)較小， 由此得到的QTL 位點(diǎn)效應(yīng)值都比較低。 任嬌嬌等用髙頻單倍體雄穗育性恢復(fù)自交系豫87-1 和4F1 分別與低頻育性恢復(fù)自交系鄭58 構(gòu)建不同遺傳背景的單倍體群體，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在“豫87-1／鄭58”群體定位到4 個(gè)與單倍體雄穗育性恢復(fù)相關(guān)的QTL 位點(diǎn)， 分別位于玉米第1、3、4 和 6 號(hào)染色體上。 其中位于 6 號(hào)染色體的 4 個(gè)位點(diǎn)在兩個(gè)群體中偏分離表現(xiàn)最顯著， 因此該片段被認(rèn)為是雄穗育性恢復(fù)非常關(guān)鍵的位點(diǎn)。

馬海林[16]通過(guò)對(duì)500 份玉米材料組成的自然群體進(jìn)行誘導(dǎo)， 對(duì)所得到的單倍體進(jìn)行兩年自然加倍率的評(píng)價(jià)，結(jié)合50 k SNP 芯片的基因分析，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析手段，檢測(cè)到有22 個(gè)與單倍體自然加倍相關(guān)的SNP 位點(diǎn)，但每個(gè)位點(diǎn)的效應(yīng)值也比較低，只有位于六號(hào)染色體上的3 個(gè)連續(xù)的SNP 位點(diǎn)最高，但也只有6%。 Sugihara 等[17]通過(guò)物理誘導(dǎo)方法，用疊氮化鈉對(duì)玉米自交系B55 的種子進(jìn)行處理，然后再與誘導(dǎo)系RWS 進(jìn)行雜交，其自然加倍率能夠顯著提升。

1.2 化學(xué)加倍

通過(guò)自然加倍可以獲得少量的玉米雙單倍體籽粒， 但因?yàn)樾鬯胗曰謴?fù)率太低而導(dǎo)致自然加倍率太低，用化學(xué)加倍方法對(duì)玉米單倍體進(jìn)行加倍，可以提高單倍體的育性恢復(fù)效率。 目前在單倍體加倍上最常用的藥劑是秋水仙素。 秋水仙素與微管蛋白相結(jié)合，可以抑制微管形成，使染色體加倍。 應(yīng)用秋水仙素進(jìn)行化學(xué)加倍的方法大致有浸種法、注射法、浸根法和浸芽法4 種。

1.2.1 浸種法 用秋水仙素處理種子前后需要用清水浸泡。 處理前用清水浸泡12 h， 然后再用濃度為0.6 mg/mL 的秋水仙素浸泡種子24 h，之后再用清水沖洗種子6 h，這樣發(fā)芽率通常能夠達(dá)到85%~90%，種子發(fā)芽率隨著遺傳背景不同也會(huì)有所不同[18]。

1.2.2 浸根法 這種方法適用于對(duì)已經(jīng)發(fā)芽的單倍體或者單倍體幼苗。 對(duì)單倍體幼苗在三葉期時(shí)用0.15%的秋水仙素浸泡3 h， 其單倍體雄性育性恢復(fù)率可以達(dá)到30%~60%之間。 徐國(guó)良等[19]采用浸根法對(duì)3 葉期單倍體的根部進(jìn)行處理，研究結(jié)果表明，濃度為0.02%秋水仙素浸泡加倍效果最高。

1.2.3 浸苗法 最高效的浸苗法是Deimling[20]在Gayen 等[21]提出的方法上經(jīng)過(guò)改進(jìn)形成，將幼苗根部切除20~30 mm， 在黑暗中將處理過(guò)的幼苗浸泡在0.06%的秋水仙素溶液中12 h， 然后在溫室中種植，到5~6 葉期再移到田間。 Eder and Chalyk[22]將這個(gè)方法應(yīng)用在多個(gè)不同遺傳背景的玉米材料中， 平均加倍效率高達(dá)49%。

1.2.4 浸芽法 將單倍體種子發(fā)芽后， 切掉芽尖1～2 mm， 在 濃度為0.06%~0.08%的秋水仙素和 2%的二甲基亞砜混合溶液中浸泡8~12 h， 再用清水沖洗1~2 h。

1.2.5 注射法 秋水仙素的濃度， 注射量和注射植株的部位成為能否加倍成功的制約因素，Chase[23]用0.05%的秋水仙素溶液和10%的甘油注射單倍體根尖，結(jié)實(shí)率可以提高3 倍。Eder 等[22]對(duì)幼苗用0.125%的秋水仙素溶液和0.05%的DMSO 注射， 其結(jié)實(shí)率可以達(dá)到8.1%。 劉志增等[24]研究發(fā)現(xiàn)用0.1%的秋水仙素溶液在幼苗六葉期進(jìn)行注射效率最高。

1.2.6 其他試劑 秋水仙素是一種毒性藥劑， 如果操作不當(dāng)或長(zhǎng)時(shí)間使用可能會(huì)導(dǎo)致人中毒，因此，選擇替代品來(lái)進(jìn)行加倍就顯得十分重要。 吲哚乙酸、生長(zhǎng)素等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，磺胺劑、藜蘆堿及麻醉劑等次級(jí)代謝產(chǎn)物以及有機(jī)砷、 有機(jī)汞等物質(zhì)也能誘導(dǎo)染色體加倍。 一些除草劑類物質(zhì)（如磷酰胺、苯基酰胺、氟樂(lè)靈、氨磺樂(lè)靈、拿草特等）也可使植物的染色體加倍[25]。 Wan[26]等用拿草特、甲基胺草磷、氟樂(lè)靈和安磺靈這 4 種藥劑對(duì)玉米的愈傷組織進(jìn)行處理后，也得到了加倍植株。慈佳賓[27]等人用氟樂(lè)靈和拿草特兩種除草劑研究表明， 這兩種藥劑也具有加倍的效果。 惠國(guó)強(qiáng)[28]等人對(duì)炔苯酰草胺、甲基胺草磷和氟樂(lè)靈等加倍藥劑的研究也發(fā)現(xiàn)這3 種藥劑可以提高單倍體加倍效率。

1.2.7 物理加倍方法 利用物X 射線， 中子輻射等物理方法也可以加倍單倍體， 但加倍效果不理想。Kato[29]發(fā)現(xiàn) N2O 也具有加倍功能，在小麥等作物上成功應(yīng)用。

2 影響單倍體加倍的因素

2.1 影響自然加倍的因素

2.1.1 遺傳因素的影響 自然加倍包括雄穗自然加倍和雌穗自然加倍， 其中單倍體雌穗育性恢復(fù)率可達(dá)90.52%， 影響單倍體加倍率的限制性因素主要是雄穗育性， 所以文章主要討論遺傳因素和非遺傳因素是對(duì)雄穗育性恢復(fù)的影響。

自然加倍效率在同一作物不同基因型的材料中浮動(dòng)都較大[30]，尤其是對(duì)于玉米，隨著遺傳背景不同，其自然加倍效率有著很大差異。 Kleiber 等[31]對(duì)大約200 份玉米種質(zhì)材料進(jìn)行了單倍體自然加倍能力的研究，研究結(jié)果表明，溫帶骨干種質(zhì)材料比溫帶地方種質(zhì)的自然加倍效率要高， 早熟品種比晚熟品種的自然加倍效率要高。

2.1.2 非遺傳因素的影響法 Kleiber[31]對(duì)不同材料在大田環(huán)境和溫室環(huán)境下進(jìn)行單倍體自然加倍效率研究發(fā)現(xiàn)， 相同材料在溫室環(huán)境下是在大田環(huán)境下的3 倍。 國(guó)內(nèi)公認(rèn)的比較好的單倍體自然加倍地點(diǎn)是海南[32]和甘肅[33]。吳鵬昊[34]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，海南和甘肅這兩個(gè)地區(qū)的整體氣溫比較穩(wěn)定， 在單倍體散粉時(shí)期不會(huì)遭遇較高溫度，并且還會(huì)具有一定溫差，這對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育非常有利。

2.2 影響化學(xué)加倍的因素

2.2.1 處理時(shí)期 處理的植物組織必須是在植物細(xì)胞分裂最旺盛的時(shí)期， 困此用化學(xué)加倍必須是在浸泡種子之后，或者生根發(fā)芽，或者幼株時(shí)期進(jìn)行加倍處理才可以達(dá)到加倍的效果。

2.2.2 操作方法 用秋水仙素對(duì)玉米單倍體加倍的最佳浸泡時(shí)間在10 h 左右，而造成不同加倍效果的原因是由秋水仙素藥劑的溫度、濃度以及種子自身生命狀態(tài)決定的。 有關(guān)試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)濃度為0.8 mg/mL時(shí)，加倍率最高，極顯著高于其他濃度。曹孜義[35]等人研究表明，在11℃～17℃低溫下對(duì)單倍體進(jìn)行秋水仙素處理，然后在25℃常溫下讓植物生長(zhǎng)，可有效提高單倍體加倍率。

2.2.3 除草劑（替代劑）使用 單倍體的自然加倍率太低，而秋水仙素毒性強(qiáng)，使用不當(dāng)對(duì)單倍體苗、人和環(huán)境均可產(chǎn)生危害[36]。有學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)甲基胺草磷在濃度為80 μmol/L 加倍效果最好，可達(dá)到30%的加倍率，這與慈佳賓等[37]、惠國(guó)強(qiáng)等[38]和王賀等[39]的研究結(jié)果相一致。 張良君等研究結(jié)果表明, 濃度為100 μmol/L 的 APM 滴心法加倍率最好[40]。 陳寶建等研究發(fā)現(xiàn)APM 在濃度為1 μmol/L 時(shí)處理單倍體幼胚 72 h， 其成株散粉率最高， 可以達(dá)到 37%[41]，其APM 處理的濃度低于程江等[42]研究中的80 μmol/L，這是因?yàn)橛着邔?duì)APM 的耐受性要低于種子和幼苗。

2.2.4 二甲基亞砜 白守信等[43]研究表明，二甲基亞砜可以有效地提高單倍體加倍的頻率，李志武等[44]研究發(fā)現(xiàn)，加入濃度為1%～3%的二甲基亞砜有助于提高小麥染色體加倍。 加入濃度為2%～5%的二甲基亞砜，也有助于提高玉米單倍體加倍效率。

2.2.5 生長(zhǎng)環(huán)境 良好的生長(zhǎng)環(huán)境也是提高單倍體加倍率的重要因素之一。 因此在用化學(xué)藥劑處理單倍體后，應(yīng)立即用大量清水沖洗6 h，加強(qiáng)田間管理也是決定單倍體能否成活的重要原因。

玉米是世界第一大糧食作物， 而玉米科研育種時(shí)間緊、任務(wù)重，只有選育出優(yōu)良玉米自交系才可以選育出優(yōu)良的玉米雜交種。 單倍體加倍育種技術(shù)可以縮短育種年限，快速獲得純合的優(yōu)良玉米自交系。單倍體育種也是目前被廣泛應(yīng)用的現(xiàn)代高效育種技術(shù)和育種方法。 自然加倍和化學(xué)加倍都存在致命的硬傷，自然加倍的加倍率非常低，化學(xué)試劑的使用雖然可以有效提高加倍率，但對(duì)人、牲畜和環(huán)境都有一定危害。 所以如何進(jìn)行單倍體加倍方法的優(yōu)化和提高單倍體效率， 是現(xiàn)在單倍體育種面臨的一個(gè)非常重要的難題。