顏崇兵 馬 俐 張瀟月 張紅專 孫婧婧 沈云琳

上海市兒童醫(yī)院 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒科(上海 200062)

新生兒窒息是指由于分娩過程中的各種原因使新生兒出生后不能建立正常呼吸，引起低氧血癥、高碳酸血癥、代謝性酸中毒，嚴(yán)重時可導(dǎo)致全身多臟器損害的一種病理生理狀況[1]。由于新生兒腎血流量占心輸出量少，對腎血流量的改變十分敏感，當(dāng)新生兒窒息時可導(dǎo)致血流重新分布，極易發(fā)生急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）。目前AKI的診斷主要依靠血清肌酐和尿量，但是血清肌酐往往受到母親因素的影響，而且新生兒AKI很少出現(xiàn)少尿，因此早期發(fā)現(xiàn)新生兒AKI比較困難。金屬蛋白酶組織抑制劑-2（tissue inhibitor of metalloproteinases-2，TIMP-2）和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-7（insulin-like growth factor-binding protein 7，IGFBP7）是兩種重要的細(xì)胞周期停滯標(biāo)志物。目前有研究認(rèn)為，不論是對于心臟外科術(shù)后、成人內(nèi)科患者，還是兒科患者，IGFBP7×TIMP-2（兩種指標(biāo)濃度相乘）均在早期明顯增高，有較好的應(yīng)用價值[2-6]，但尚未見該聯(lián)合指標(biāo)在新生兒AKI中的應(yīng)用報(bào)道。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）動態(tài)測定住院重度窒息新生兒尿中細(xì)胞周期停滯相關(guān)標(biāo)志物TIMP-2 和IGFBP 7濃度變化情況，以了解IGFBP7×TIMP-2在重度窒息新生兒AKI中的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2019 年1 月至2020 年6 月入住上海市兒童醫(yī)院新生兒科的重度窒息新生兒作為研究對象，入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合2016 年中華醫(yī)學(xué)會圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)分會新生兒復(fù)蘇學(xué)組提出的新生兒重度窒息診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，即Apgar評分1分鐘≤3分，或5分鐘≤5分，伴臍動脈血 pH值＜7.0；②生后6 h內(nèi)入院。排除標(biāo)準(zhǔn)：①出生體質(zhì)量＜1 500 g；②有嚴(yán)重先天性畸形、先天性腎臟疾病、染色體異常、圍生期感染、腫瘤、甲狀腺疾病的患兒；③住院期間行連續(xù)性腎臟替代治療；④母親孕期及新生兒使用腎毒性藥物。

本研究經(jīng)上海市兒童醫(yī)院倫理委員會審查通過，患兒家長簽訂知情同意書。

根據(jù)是否發(fā)生AKI，將入選重度窒息新生兒分為AKI組和非AKI組。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集研究對象的性別、胎齡、出生體質(zhì)量、1分鐘和5分鐘Apgar評分等一般資料。

1.2.2 標(biāo)本采集及檢測 所有患兒于入院當(dāng)時、生后24 h、48 h和1周留取新鮮尿液標(biāo)本2～5 mL（采用一次性外置型集尿袋收集尿液，如因?yàn)楦鞣N原因留置導(dǎo)尿的則通過導(dǎo)尿管收集），離心后取上清液置-80 ℃ 冰箱保存，用于檢測尿細(xì)胞周期停滯相關(guān)生物標(biāo)志物TIMP-2 和IGFBP 7 水平的動態(tài)變化；同時各時間點(diǎn)分別留取血標(biāo)本1 mL，離心后收集血清并置于-80 ℃冰箱保存，用于檢測血清肌酐水平。尿液TIMP-2和IGFBP7的ELISA試劑盒均購自ABclonal公司，并嚴(yán)格按說明書操作。IGFBP7×TIMP-2為IGFBP7和TIMP-2兩者濃度相乘再除以1000得出的結(jié)果。血清肌酐采用HITACHI 7180自動分析儀測定。所有患兒均記錄尿量，以評估是否存在AKI。

1.2.3 新生兒AKI 診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)全球改善腎臟病預(yù)后委員會（kidney disease:improving global outcome，KDIGO）發(fā)布的AKI 臨床實(shí)踐指南標(biāo)準(zhǔn)中新生兒AKI 的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行診斷，即48 h 內(nèi)血肌酐上升26.5 μmol/L（0.3 mg/dL）或較基礎(chǔ)值升高 ≥50%；和/或24 h尿量＜1.0 mL/(kg·h)（排除梗阻性腎病或脫水狀態(tài)）。

1.2.4 觀察指標(biāo) 主要觀察指標(biāo)為重度窒息新生兒尿液細(xì)胞周期停滯標(biāo)志物IGFBP 7×TIMP-2 動態(tài)變化；次要觀察指標(biāo)為重度窒息新生兒AKI的發(fā)生率以及血清肌酐的動態(tài)變化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)（P25～P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析尿液IGFBP7×TIMP-2診斷窒息新生兒發(fā)生AKI的臨床意義。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

符合募集條件的新生兒共58例，家長知情并同意被募集的新生兒53例，排除1例有嚴(yán)重先天畸形者及1例，有巨大腹腔占位者，最終納入正式分析的新生兒共51例。51例新生兒中，男26例、女25例，平均胎齡（38.34±1.71）周，出生體質(zhì)量（3 130.6±460.2）g。

AKI組9例，發(fā)生率為17.65%，其中男5例、女4例；非AKI組42例，男21例、女21例。兩組間性別、胎齡、出生體質(zhì)量，1分鐘和5分鐘Apgar評分的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組新生兒一般資料比較

51例新生兒有48例新生兒行全身亞低溫治療，3例患兒因入院時病情危重、生命體征不穩(wěn)定未能行亞低溫治療。AKI 組新生兒中有1 例因重度窒息合并多臟器功能障礙綜合征，經(jīng)治療無效于生后43 h 死亡，僅留取了入院時和生后24 h的樣本。AKI組其他新生兒與非AKI組新生兒均治愈出院。

2.2 兩組新生兒尿液TIMP-2、IGFBP7、IGFBP7× TIMP-2及血清肌酐比較

與非AKI組相比，AKI組新生兒入院時、生后24 h 尿液中TIMP-2濃度明顯增高，入院時尿IGFBP7濃度增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AKI組新生兒入院時、生后24 h尿IGFBP7×TIMP-2較非AKI組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組間血清肌酐濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 入院時尿液IGFBP7×TIMP-2對重度窒息新生兒AKI發(fā)生的診斷價值

采用ROC 曲線分析重度窒息新生兒尿液IGFBP7×TIMP-2對AKI的診斷價值（圖1），重度窒息新生兒入院時尿液IGFBP 7×TIMP-2 預(yù)測AKI 的曲線下面積（AUC）為0.905（95%CI：0.820～0.990），當(dāng)臨界濃度為0.306 (ng/mL)2時，診斷AKI的靈敏度為100%，特異度為89.0%；重度窒息新生兒生后24時尿液IGFBP 7×TIMP-2預(yù)測AKI 的AUC 為0.729（95%CI：0.482～0.977）。

圖1 重度窒息新生兒尿液IGFBP7×TIMP-2 對AKI 診斷預(yù)測價值的ROC 分析

3 討論

新生兒窒息是圍生期新生兒死亡和致殘的主要原因之一[1]。全球每年約有400萬新生兒經(jīng)歷出生時窒息，每年有約90.4萬新生兒死亡，幸存者易出現(xiàn)缺氧缺血性后遺癥，部分甚至存在終生的精神和身體殘 疾[9]。因此新生兒窒息后重要臟器損傷的預(yù)防和治療，一直是基礎(chǔ)科學(xué)和臨床研究的重點(diǎn)。最近的全國新生兒窒息多器官損害臨床診斷多中心研究協(xié)作組研究顯示，在487 例重度窒息和輕度窒息新生兒中腎損害高達(dá)36.2%和26.7%[10]，故需重視其發(fā)生機(jī)制的相關(guān)研究。

AKI是指各種原因引起的急性腎臟功能下降，可伴或不伴有少尿或無尿的一組臨床癥候群。由于新生兒腎血流量占心輸出量少，對腎血流量的改變十分敏感，當(dāng)窒息、低血容量等原因?qū)е卵髦匦路植紩r，極易發(fā)生AKI。根據(jù)目前國外的報(bào)道，在窒息新生兒或亞低溫治療的新生兒中，AKI 的發(fā)生率可達(dá)36%～70%[11-12]。在新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房中，AKI 的發(fā)病率約8%～24%[13]。本研究中，新生兒重度窒息后AKI發(fā)生率為17.65%，與國外文獻(xiàn)報(bào)道相仿。

腎小管上皮細(xì)胞是成人和新生兒AKI 時的主要受損細(xì)胞，也是腎臟損傷后再生修復(fù)最主要的細(xì)胞來源。影響腎小管上皮細(xì)胞損傷修復(fù)的因素很多，其中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)對于腎小管上皮細(xì)胞損傷修復(fù)過程起至關(guān)重要的作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，TIMP-2 和IGFBP-7的相對分子質(zhì)量分別為24 000和29 000，在細(xì)胞損傷（如氧化應(yīng)激、毒素、缺血、敗血癥、炎癥）的早期階段由腎小管上皮細(xì)胞通過自分泌和旁分泌模式分泌。其中TIMP-2刺激p27蛋白表達(dá)，IGFBP7直接增加p53和p21蛋白的表達(dá)，從而阻斷周期蛋白依賴蛋白激酶復(fù)合物CyclD-CDK4和CyclE-CDK2促進(jìn)細(xì)胞周期的作用，導(dǎo)致短暫的G1細(xì)胞周期停滯，為細(xì)胞提供修復(fù)DNA損傷和恢復(fù)功能的機(jī)會[2,15-17]。這一過程發(fā)生在早期細(xì)胞應(yīng)激過程中，有助于防止進(jìn)一步的DNA 損傷和分裂，但持續(xù)的細(xì)胞周期阻滯會導(dǎo)致纖維化[17]。

2013年曾報(bào)道了細(xì)胞周期停滯標(biāo)志物TIMP-2和IGFBP 7 在AKI 中的早期預(yù)測作用，該研究評估了超過300種不同的AKI早期生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)尿TIMP-2和IGFBP 7 乘積（IGFBP 7×TIMP-2）作為預(yù)測AKI早期生物標(biāo)志物的AUC 為0.80，明顯優(yōu)于單一指標(biāo)或其他生物標(biāo)志物，包括中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白（neutrophil gelatinase-related apolipoprotein,NGAL）、腎損傷分子1（kidney injury molecule-1,KIM-1）和白介素（IL）-18 等[3]。隨后陸續(xù)有研究顯示，TIMP-2 和IGFBP 7 是早期識別AKI 的新型腎損傷標(biāo)志物。在具有AKI 高風(fēng)險的住院患者中檢測尿TIMP-2 和IGFBP 7，可以早期識別AKI，其預(yù)測AKI的靈敏度為78%，特異度為89%，AUC為0.78[4]。另有研究也發(fā)現(xiàn)，IGFBP7×TIMP-2可早期預(yù)測ICU中的危重患者AKI的發(fā)生，其靈敏度為73.5%，特異度為71.4%，IGFBP 7×TIMP-2＜0.8(ng/mL)2的患者可排除需腎臟替代治療的可能[5]。在一項(xiàng)150例兒童體外循環(huán)手術(shù)后預(yù)測AKI 生物標(biāo)志物的研究中也發(fā)現(xiàn)，術(shù)后6小時TIMP-2和IGFBP7明顯增高，兩者的高表達(dá)可高度預(yù)測AKI發(fā)生的可能性[6]。對于接受大手術(shù)、心臟手術(shù)的患者、血流動力學(xué)不穩(wěn)定或膿毒癥患者，IGFBP7×TIMP-2是目前預(yù)測早期AKI發(fā)生最好的生物標(biāo)志物，以便進(jìn)行早期診斷和干預(yù)[2]。

本研究觀察了重度窒息新生兒尿液細(xì)胞周期停滯標(biāo)志物TIMP-2、IGFBP-2 及其乘積（IGFBP 7× TIMP-2）及血清肌酐的動態(tài)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)與非AKI 組相比，AKI 組新生兒入院時、生后24 h 尿液中IGFBP 7×TIMP-2 表達(dá)明顯增高，優(yōu)于兩者單一指標(biāo)。且采用相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，重度窒息新生兒尿液IGFBP 7×TIMP-2 與血清肌酐濃度呈顯著正相關(guān)。本研究通過ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，入院時尿液IGFBP 7×TIMP-2 診斷重度窒息新生兒AKI 的AUC 為0.905（95%CI：0.820～0.990），臨界濃度為 0.306(ng/mL)2時，預(yù)測重度窒息新生兒發(fā)生AKI 的敏感度為100%，特異度為89.0%。血清肌酐濃度雖然是診斷AKI 的KDIGO 標(biāo)準(zhǔn)之一，但是一般升高比較晚，在腎損傷后48～72 h 才升高；而且新生兒出生后幾天內(nèi)的血清肌酐濃度反映的是母親的腎功能，而不是新生兒的腎功能。本研究發(fā)現(xiàn)，AKI 組的血清肌酐濃度雖較非AKI組有增高趨勢，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)尿液細(xì)胞周期停滯標(biāo)志物IGFBP 7×TIMP-2 在重度窒息新生兒生后早期可明顯增高，有助于早期識別AKI 的發(fā)生。今后有必要進(jìn)一步擴(kuò)大研究樣本，明確尿液IGFBP7×TIMP-2在早期診斷AKI中的確切臨床價值。