顏崇兵 馬 俐 張瀟月 張紅專 孫婧婧 沈云琳

上海市兒童醫(yī)院 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒科(上海 200062)

新生兒窒息是指由于分娩過(guò)程中的各種原因使新生兒出生后不能建立正常呼吸，引起低氧血癥、高碳酸血癥、代謝性酸中毒，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致全身多臟器損害的一種病理生理狀況[1]。由于新生兒腎血流量占心輸出量少，對(duì)腎血流量的改變十分敏感，當(dāng)新生兒窒息時(shí)可導(dǎo)致血流重新分布，極易發(fā)生急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）。目前AKI的診斷主要依靠血清肌酐和尿量，但是血清肌酐往往受到母親因素的影響，而且新生兒AKI很少出現(xiàn)少尿，因此早期發(fā)現(xiàn)新生兒AKI比較困難。金屬蛋白酶組織抑制劑-2（tissue inhibitor of metalloproteinases-2，TIMP-2）和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-7（insulin-like growth factor-binding protein 7，IGFBP7）是兩種重要的細(xì)胞周期停滯標(biāo)志物。目前有研究認(rèn)為，不論是對(duì)于心臟外科術(shù)后、成人內(nèi)科患者，還是兒科患者，IGFBP7×TIMP-2（兩種指標(biāo)濃度相乘）均在早期明顯增高，有較好的應(yīng)用價(jià)值[2-6]，但尚未見(jiàn)該聯(lián)合指標(biāo)在新生兒AKI中的應(yīng)用報(bào)道。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）動(dòng)態(tài)測(cè)定住院重度窒息新生兒尿中細(xì)胞周期停滯相關(guān)標(biāo)志物TIMP-2 和IGFBP 7濃度變化情況，以了解IGFBP7×TIMP-2在重度窒息新生兒AKI中的臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019 年1 月至2020 年6 月入住上海市兒童醫(yī)院新生兒科的重度窒息新生兒作為研究對(duì)象，入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合2016 年中華醫(yī)學(xué)會(huì)圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)分會(huì)新生兒復(fù)蘇學(xué)組提出的新生兒重度窒息診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，即Apgar評(píng)分1分鐘≤3分，或5分鐘≤5分，伴臍動(dòng)脈血 pH值＜7.0；②生后6 h內(nèi)入院。排除標(biāo)準(zhǔn)：①出生體質(zhì)量＜1 500 g；②有嚴(yán)重先天性畸形、先天性腎臟疾病、染色體異常、圍生期感染、腫瘤、甲狀腺疾病的患兒；③住院期間行連續(xù)性腎臟替代治療；④母親孕期及新生兒使用腎毒性藥物。

本研究經(jīng)上海市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)，患兒家長(zhǎng)簽訂知情同意書(shū)。

根據(jù)是否發(fā)生AKI，將入選重度窒息新生兒分為AKI組和非AKI組。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集研究對(duì)象的性別、胎齡、出生體質(zhì)量、1分鐘和5分鐘Apgar評(píng)分等一般資料。

1.2.2 標(biāo)本采集及檢測(cè) 所有患兒于入院當(dāng)時(shí)、生后24 h、48 h和1周留取新鮮尿液標(biāo)本2～5 mL（采用一次性外置型集尿袋收集尿液，如因?yàn)楦鞣N原因留置導(dǎo)尿的則通過(guò)導(dǎo)尿管收集），離心后取上清液置-80 ℃ 冰箱保存，用于檢測(cè)尿細(xì)胞周期停滯相關(guān)生物標(biāo)志物TIMP-2 和IGFBP 7 水平的動(dòng)態(tài)變化；同時(shí)各時(shí)間點(diǎn)分別留取血標(biāo)本1 mL，離心后收集血清并置于-80 ℃冰箱保存，用于檢測(cè)血清肌酐水平。尿液TIMP-2和IGFBP7的ELISA試劑盒均購(gòu)自ABclonal公司，并嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。IGFBP7×TIMP-2為IGFBP7和TIMP-2兩者濃度相乘再除以1000得出的結(jié)果。血清肌酐采用HITACHI 7180自動(dòng)分析儀測(cè)定。所有患兒均記錄尿量，以評(píng)估是否存在AKI。

1.2.3 新生兒AKI 診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)全球改善腎臟病預(yù)后委員會(huì)（kidney disease:improving global outcome，KDIGO）發(fā)布的AKI 臨床實(shí)踐指南標(biāo)準(zhǔn)中新生兒AKI 的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行診斷，即48 h 內(nèi)血肌酐上升26.5 μmol/L（0.3 mg/dL）或較基礎(chǔ)值升高 ≥50%；和/或24 h尿量＜1.0 mL/(kg·h)（排除梗阻性腎病或脫水狀態(tài)）。

1.2.4 觀察指標(biāo) 主要觀察指標(biāo)為重度窒息新生兒尿液細(xì)胞周期停滯標(biāo)志物IGFBP 7×TIMP-2 動(dòng)態(tài)變化；次要觀察指標(biāo)為重度窒息新生兒AKI的發(fā)生率以及血清肌酐的動(dòng)態(tài)變化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)（P25～P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析尿液IGFBP7×TIMP-2診斷窒息新生兒發(fā)生AKI的臨床意義。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

符合募集條件的新生兒共58例，家長(zhǎng)知情并同意被募集的新生兒53例，排除1例有嚴(yán)重先天畸形者及1例，有巨大腹腔占位者，最終納入正式分析的新生兒共51例。51例新生兒中，男26例、女25例，平均胎齡（38.34±1.71）周，出生體質(zhì)量（3 130.6±460.2）g。

AKI組9例，發(fā)生率為17.65%，其中男5例、女4例；非AKI組42例，男21例、女21例。兩組間性別、胎齡、出生體質(zhì)量，1分鐘和5分鐘Apgar評(píng)分的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組新生兒一般資料比較

51例新生兒有48例新生兒行全身亞低溫治療，3例患兒因入院時(shí)病情危重、生命體征不穩(wěn)定未能行亞低溫治療。AKI 組新生兒中有1 例因重度窒息合并多臟器功能障礙綜合征，經(jīng)治療無(wú)效于生后43 h 死亡，僅留取了入院時(shí)和生后24 h的樣本。AKI組其他新生兒與非AKI組新生兒均治愈出院。

2.2 兩組新生兒尿液TIMP-2、IGFBP7、IGFBP7× TIMP-2及血清肌酐比較

與非AKI組相比，AKI組新生兒入院時(shí)、生后24 h 尿液中TIMP-2濃度明顯增高，入院時(shí)尿IGFBP7濃度增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AKI組新生兒入院時(shí)、生后24 h尿IGFBP7×TIMP-2較非AKI組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組間血清肌酐濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 入院時(shí)尿液IGFBP7×TIMP-2對(duì)重度窒息新生兒AKI發(fā)生的診斷價(jià)值

采用ROC 曲線分析重度窒息新生兒尿液IGFBP7×TIMP-2對(duì)AKI的診斷價(jià)值（圖1），重度窒息新生兒入院時(shí)尿液IGFBP 7×TIMP-2 預(yù)測(cè)AKI 的曲線下面積（AUC）為0.905（95%CI：0.820～0.990），當(dāng)臨界濃度為0.306 (ng/mL)2時(shí)，診斷AKI的靈敏度為100%，特異度為89.0%；重度窒息新生兒生后24時(shí)尿液IGFBP 7×TIMP-2預(yù)測(cè)AKI 的AUC 為0.729（95%CI：0.482～0.977）。

圖1 重度窒息新生兒尿液IGFBP7×TIMP-2 對(duì)AKI 診斷預(yù)測(cè)價(jià)值的ROC 分析

3 討論

新生兒窒息是圍生期新生兒死亡和致殘的主要原因之一[1]。全球每年約有400萬(wàn)新生兒經(jīng)歷出生時(shí)窒息，每年有約90.4萬(wàn)新生兒死亡，幸存者易出現(xiàn)缺氧缺血性后遺癥，部分甚至存在終生的精神和身體殘 疾[9]。因此新生兒窒息后重要臟器損傷的預(yù)防和治療，一直是基礎(chǔ)科學(xué)和臨床研究的重點(diǎn)。最近的全國(guó)新生兒窒息多器官損害臨床診斷多中心研究協(xié)作組研究顯示，在487 例重度窒息和輕度窒息新生兒中腎損害高達(dá)36.2%和26.7%[10]，故需重視其發(fā)生機(jī)制的相關(guān)研究。

AKI是指各種原因引起的急性腎臟功能下降，可伴或不伴有少尿或無(wú)尿的一組臨床癥候群。由于新生兒腎血流量占心輸出量少，對(duì)腎血流量的改變十分敏感，當(dāng)窒息、低血容量等原因?qū)е卵髦匦路植紩r(shí)，極易發(fā)生AKI。根據(jù)目前國(guó)外的報(bào)道，在窒息新生兒或亞低溫治療的新生兒中，AKI 的發(fā)生率可達(dá)36%～70%[11-12]。在新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房中，AKI 的發(fā)病率約8%～24%[13]。本研究中，新生兒重度窒息后AKI發(fā)生率為17.65%，與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道相仿。

腎小管上皮細(xì)胞是成人和新生兒AKI 時(shí)的主要受損細(xì)胞，也是腎臟損傷后再生修復(fù)最主要的細(xì)胞來(lái)源。影響腎小管上皮細(xì)胞損傷修復(fù)的因素很多，其中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)對(duì)于腎小管上皮細(xì)胞損傷修復(fù)過(guò)程起至關(guān)重要的作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，TIMP-2 和IGFBP-7的相對(duì)分子質(zhì)量分別為24 000和29 000，在細(xì)胞損傷（如氧化應(yīng)激、毒素、缺血、敗血癥、炎癥）的早期階段由腎小管上皮細(xì)胞通過(guò)自分泌和旁分泌模式分泌。其中TIMP-2刺激p27蛋白表達(dá)，IGFBP7直接增加p53和p21蛋白的表達(dá)，從而阻斷周期蛋白依賴蛋白激酶復(fù)合物CyclD-CDK4和CyclE-CDK2促進(jìn)細(xì)胞周期的作用，導(dǎo)致短暫的G1細(xì)胞周期停滯，為細(xì)胞提供修復(fù)DNA損傷和恢復(fù)功能的機(jī)會(huì)[2,15-17]。這一過(guò)程發(fā)生在早期細(xì)胞應(yīng)激過(guò)程中，有助于防止進(jìn)一步的DNA 損傷和分裂，但持續(xù)的細(xì)胞周期阻滯會(huì)導(dǎo)致纖維化[17]。

2013年曾報(bào)道了細(xì)胞周期停滯標(biāo)志物TIMP-2和IGFBP 7 在AKI 中的早期預(yù)測(cè)作用，該研究評(píng)估了超過(guò)300種不同的AKI早期生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)尿TIMP-2和IGFBP 7 乘積（IGFBP 7×TIMP-2）作為預(yù)測(cè)AKI早期生物標(biāo)志物的AUC 為0.80，明顯優(yōu)于單一指標(biāo)或其他生物標(biāo)志物，包括中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白（neutrophil gelatinase-related apolipoprotein,NGAL）、腎損傷分子1（kidney injury molecule-1,KIM-1）和白介素（IL）-18 等[3]。隨后陸續(xù)有研究顯示，TIMP-2 和IGFBP 7 是早期識(shí)別AKI 的新型腎損傷標(biāo)志物。在具有AKI 高風(fēng)險(xiǎn)的住院患者中檢測(cè)尿TIMP-2 和IGFBP 7，可以早期識(shí)別AKI，其預(yù)測(cè)AKI的靈敏度為78%，特異度為89%，AUC為0.78[4]。另有研究也發(fā)現(xiàn)，IGFBP7×TIMP-2可早期預(yù)測(cè)ICU中的危重患者AKI的發(fā)生，其靈敏度為73.5%，特異度為71.4%，IGFBP 7×TIMP-2＜0.8(ng/mL)2的患者可排除需腎臟替代治療的可能[5]。在一項(xiàng)150例兒童體外循環(huán)手術(shù)后預(yù)測(cè)AKI 生物標(biāo)志物的研究中也發(fā)現(xiàn)，術(shù)后6小時(shí)TIMP-2和IGFBP7明顯增高，兩者的高表達(dá)可高度預(yù)測(cè)AKI發(fā)生的可能性[6]。對(duì)于接受大手術(shù)、心臟手術(shù)的患者、血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定或膿毒癥患者，IGFBP7×TIMP-2是目前預(yù)測(cè)早期AKI發(fā)生最好的生物標(biāo)志物，以便進(jìn)行早期診斷和干預(yù)[2]。

本研究觀察了重度窒息新生兒尿液細(xì)胞周期停滯標(biāo)志物TIMP-2、IGFBP-2 及其乘積（IGFBP 7× TIMP-2）及血清肌酐的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)與非AKI 組相比，AKI 組新生兒入院時(shí)、生后24 h 尿液中IGFBP 7×TIMP-2 表達(dá)明顯增高，優(yōu)于兩者單一指標(biāo)。且采用相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，重度窒息新生兒尿液IGFBP 7×TIMP-2 與血清肌酐濃度呈顯著正相關(guān)。本研究通過(guò)ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，入院時(shí)尿液IGFBP 7×TIMP-2 診斷重度窒息新生兒AKI 的AUC 為0.905（95%CI：0.820～0.990），臨界濃度為 0.306(ng/mL)2時(shí)，預(yù)測(cè)重度窒息新生兒發(fā)生AKI 的敏感度為100%，特異度為89.0%。血清肌酐濃度雖然是診斷AKI 的KDIGO 標(biāo)準(zhǔn)之一，但是一般升高比較晚，在腎損傷后48～72 h 才升高；而且新生兒出生后幾天內(nèi)的血清肌酐濃度反映的是母親的腎功能，而不是新生兒的腎功能。本研究發(fā)現(xiàn)，AKI 組的血清肌酐濃度雖較非AKI組有增高趨勢(shì)，但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)尿液細(xì)胞周期停滯標(biāo)志物IGFBP 7×TIMP-2 在重度窒息新生兒生后早期可明顯增高，有助于早期識(shí)別AKI 的發(fā)生。今后有必要進(jìn)一步擴(kuò)大研究樣本，明確尿液IGFBP7×TIMP-2在早期診斷AKI中的確切臨床價(jià)值。