劉星吟，王 芳，王攀琦，劉 洋，劉復(fù)興，寧志豐

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

肝癌的發(fā)病率居于所有惡性腫瘤的第5位，是全球最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居于第3位[1]。肝癌在我國高發(fā)，主要風(fēng)險因素包括感染乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)，長期食用黃曲霉毒素污染的食物、酗酒，長期大量吸煙以及肝硬化等[2]。目前主要的治療手段是手術(shù)切除、放化療及介入治療等。但是由于發(fā)病機制并不明確以及早期診斷率低，甲胎蛋白(AFP)在早期肝癌中靈敏度小于40%[3]，五年生存率和總生存率仍處于較低水平。隨著研究水平不斷改進(jìn)更新，靶向治療成為一大熱點，因此，探究針對肝癌的新治療靶點意義重大。

脯氨酸-谷氨酸-亮氨酸富集蛋白1(proline-，glutamie acid-，leucine-rich protein 1，PELP1)是一種具有多功能的新型核受體輔助調(diào)節(jié)因子，定位于染色體區(qū)域17p13.2，并編碼1130個氨基酸的蛋白質(zhì)[4-5]。PELP1作為一種支架蛋白，與多種癌癥發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系(如染色質(zhì)重塑和DNA修復(fù))[6]。Gonugunta等[7]研究證實PELP1中具有兩個核仁結(jié)構(gòu)域在PELP1介導(dǎo)的核糖體功能中起重要作用。有研究報道[8]PELP1是潛在的原癌基因，動態(tài)的穿梭在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間，在多種癌癥(尤其是性激素敏感或性激素?zé)o反應(yīng)的癌癥)，如乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等中都高表達(dá)[9-16]。PELP1具有癌基因的特征，可間接影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞過程[17]，并且在多種腫瘤樣本組織中高表達(dá)，加速細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、增強腫瘤細(xì)胞遷移侵襲能力和耐藥性等，它可能成為判斷腫瘤預(yù)后的標(biāo)志物和腫瘤治療的作用靶點。

目前PELP1對于肝癌的作用尚不清楚，最近通過Oncomine數(shù)據(jù)庫研究發(fā)現(xiàn)PELP1在肝癌細(xì)胞株或者組織中高表達(dá)，預(yù)實驗應(yīng)用Western blot驗證顯示PELP1在肝癌細(xì)胞中比正常肝組織表達(dá)含量高。通過小干擾 RNA (siRNA) 沉默PELP1可抑制肝癌細(xì)胞的活力、增殖作用、克隆形成能力、遷移和侵襲能力。沉默PELP1后伴隨著STAT3信號通路及下游分子下調(diào)。因此，本文就PELP1在肝癌中發(fā)生、發(fā)展的作用為肝癌臨床靶向治療提供一些基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞系和培養(yǎng)物

人肝癌細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心。所有細(xì)胞均在DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基輔以10%胎牛血清 (Gibco)、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素中培養(yǎng)。

1.1.2 抗體和試劑

在蛋白免疫印跡實驗中闡明所需抗體。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000TM Transfection Reagent購自invitrogen公司。三對PELP1-homo-1、PELP1-homo-2、PELP1-homo-3是利用Ambion網(wǎng)站上的免費在線工具設(shè)計，由中國的吉瑪基因公司合成。siRNA 序列見表1。

表1 PELP1-homo序列

1.1.3 生物信息學(xué)

PELP1在肝癌組織或細(xì)胞系的mRNA表達(dá)獲自O(shè)ncomine數(shù)據(jù)庫(http://www.oncomine.org)。另外PELP1調(diào)控的通路信息獲自BioCarta(https://cgap.nci.nih.gov/Pathways/BioCarta-Pathways)。

1.2 方法

1.2.1 Western blot檢測細(xì)胞中PELP1的蛋白表達(dá)水平

收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，總蛋白的提取采用RIPA緩沖液(1%TritonX-100，50mM Tris-HCl pH7.2，0.1%SDS和1mM EDTA，150mM NaCl，1%脫氧膽酸鈉)。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行濃度測定。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 分離蛋白，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移PVDF上。將洗干凈的PVDF膜放置于配好的封閉液(5%脫脂牛奶或5%BSA)中孵育1h，搖床設(shè)定50round/min與以下一抗PELP1抗體(A3189，1∶2000，ABclonal)，STAT3抗體(A19566，1∶2000，ABclonal)、Phospho-stat3-Y705(AP0705，1∶2000，ABclonal)和小鼠多克隆GAPDH抗體(SC-47724，1∶5000)在4 ℃下孵育過夜。配置超敏ECL工作液，顯影，最后通過掃膜儀掃膜，以GAPDH為內(nèi)參，用目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值來表達(dá)目的蛋白水平。實驗重復(fù)3次。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

PELP1-homo-1、PELP1-homo-2、PELP1-homo-3、Negative control購于吉瑪基因(中國上海)。取對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，將密度為2×106/孔的HepG2細(xì)胞接種在6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，直至細(xì)胞融合達(dá)70%～90%。根據(jù)使用說明書，通過Lipofectamine 2000TM(Invitrogen)處理轉(zhuǎn)染，分為PELP1-homo-3敲低組及NC對照組。轉(zhuǎn)染48h后用Western blot進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率的檢測。

1.2.3 細(xì)胞活力測定

用CCK-8試劑盒測定細(xì)胞活力和增殖活性。將肝癌細(xì)胞與100μL的培養(yǎng)基(2×103/孔)一起培養(yǎng)。將轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞和對照組細(xì)胞以每孔2000個細(xì)胞的密度接種于96孔板(Costar)的完全培養(yǎng)基(添加10%FBS，1%p/s的DMEM)中，然后在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱標(biāo)準(zhǔn)條件下分別孵育12、24、48、72、96h，每孔總體積為100μL。到達(dá)固定的時間，向各孔中加入10μL CCK-8后在培養(yǎng)箱孵育2h，使用酶標(biāo)儀在450 nm處記錄光密度值。

1.2.4 平板克隆形成實驗

通過平板菌落形成測定檢查集落形成能力。將轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞與NC組接種到6cm平板(Costar)中，密度為100、300、500個細(xì)胞/板，然后在標(biāo)準(zhǔn)條件(37 ℃和5%CO2)下孵育約7d。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌細(xì)胞3次，然后用甲醇固定20min，用0.1%結(jié)晶紫染色25min后，在光學(xué)顯微鏡下以100×放大倍數(shù)計數(shù)直徑超過50μm的菌落數(shù)。通過將陽性菌落數(shù)除以接種的細(xì)胞總數(shù)來計算菌落形成速率。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實驗

將轉(zhuǎn)染PELP1-homo-3實驗組與NC組接種到6cm平板(Costar)中，每孔的密度為5×105/孔，每孔3mL的培養(yǎng)基，在5% CO2和37℃孵箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%，將孔內(nèi)培養(yǎng)液吸去，用10μL槍頭垂直于孔板劃痕，用PBS輕柔沖洗3遍后，加入培養(yǎng)基3mL后將細(xì)胞置于5% CO2和37℃的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。分別于0、6、12、24、48h觀察各組細(xì)胞向劃痕中遷移的情況。計算劃痕愈合率。

1.2.6 Transwell侵襲和遷移試驗

為了觀察Transwell小室遷移情況，首先將肝癌細(xì)胞進(jìn)行饑餓6h，然后使用無血清培養(yǎng)基重懸，之后將200μL細(xì)胞混懸液添加于上室中，下室給予含有20%FBS的DMEM。將轉(zhuǎn)染PELP1-homo-3實驗組和對照組NC(5×104個/孔)接種在小室(COSTAR)中。培養(yǎng)48～72h，小室用甲醇固定20min，0.1%結(jié)晶紫染色溶液染色25min，用棉簽除去未遷移或侵入孔的細(xì)胞。用顯微鏡從5個不同的顯微鏡視野計數(shù)膜底部的細(xì)胞并計算平均值。遷移和侵襲實驗相同的實驗方案，而侵襲實驗的上室存在基質(zhì)膠Matrigel，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基按8∶1比例稀釋Matrigel，將Matrigel鋪在Transwell小室上室，放入培養(yǎng)箱37℃靜置30min取出。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 PELP1對肝癌細(xì)胞增殖的影響

通過Oncomine數(shù)據(jù)庫評估肝癌及鄰近正常組織中PELP1的表達(dá)水平(如圖1)。發(fā)現(xiàn)肝癌組織與正常肝組織相比，PELP1在肝癌組織中顯著過表達(dá)。CCK-8檢測結(jié)果提示，沉默PELP1后與對照組NC對比，HepG2細(xì)胞活力在72h與96h明顯降低(P<0.01)，如圖2。沉默PELP1對肝癌細(xì)胞的增殖能力有抑制作用，且呈時間依賴性，該增殖作用隨著時間的延長而降低。

圖1 肝癌與正常組織的PELP1表達(dá)水平

圖2 沉默PELP1后12h、24h、48h、72h、96h與對照組細(xì)胞活力對比(*P<0.05，**P<0.01)

2.2 PELP1對肝癌細(xì)胞平板克隆形成能力的影響

平板克隆實驗主要評價單個細(xì)胞的增殖能力，PELP1-homo-3實驗組與NC對照組相比，肝癌的克隆形成率顯著降低，增殖能力受到顯著抑制，具有統(tǒng)計學(xué)意義(如圖3、4)。

圖3 沉默PELP1組與對照組NC克隆形成圖

(*P<0.05)

2.3 PELP1對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響

劃痕實驗以及遷移實驗，侵襲實驗結(jié)果提示，從48h組(圖5、6)和72h組(圖7、8)分別得出，沉默肝癌細(xì)胞的遷移能力明顯低于NC組，具有抑制作用。PELP1-homo-3實驗組有顯著減弱肝癌細(xì)胞的侵襲能力的作用。劃痕實驗結(jié)果提示沉默PELP1表達(dá)抑制了HepG2的遷移[如圖9(封三)，圖10～11]。

2.4 沉默PELP1可影響肝癌細(xì)胞中STAT3信號通路

通過Western blot實驗驗證PELP1與STAT3信號通路的關(guān)系。預(yù)實驗顯示PELP1-homo-3效果最佳(圖12、13)。經(jīng)過Western blot實驗顯示轉(zhuǎn)染PELP1-homo-3后HepG2細(xì)胞中PELP1表達(dá)下調(diào)。在STAT3信號通路中，磷酸化 STAT3則在PELP1沉默后蛋白表達(dá)水平顯著降低(圖14～17)?？傊緦嶒炏嚓P(guān)數(shù)據(jù)顯示表明沉默PELP1可以通過減少STAT3的磷酸化在體外抑制肝癌細(xì)胞的惡性特征。

圖12 預(yù)實驗的Western blot 圖13 預(yù)實驗灰度值統(tǒng)計圖

3 討 論

肝癌是全球發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一[18]，該疾病可由多種因素導(dǎo)致，早期診斷率較低，一般發(fā)現(xiàn)已經(jīng)進(jìn)入肝癌晚期。目前肝癌的靶點仍然未闡明，發(fā)病機制尚不清楚，雖然肝移植和肝切除術(shù)是可以治愈一些患者，但是復(fù)發(fā)性較強，所以，迫切需要一種新的治療策略。PELP1是一種參與基因組和非基因組雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的支架蛋白，同時PELP1是雌激素受體(ESR1和ESR2)的共激活因子[19]，雖然PELP1在肝癌中的作用尚未完全闡明，但相關(guān)研究表明，雌激素受體α參與了肝癌腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)尚認(rèn)為它是致瘤的因素[20]。

通過本次研究我們發(fā)現(xiàn)PELP1對于肝癌的生長活力、遷移能力和侵襲能力有顯著的抑制作用，并且還參與調(diào)控STAT3的信號通路及下游分子。目前PELP1參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程，尤其是在一些依賴雌激素的腫瘤中表達(dá)顯著。有研究證實，PELP1對于乳腺癌、髓母細(xì)胞瘤、腎上腺癌具有潛在的診斷和預(yù)后價值起著重要作用[21]；還有研究利用抑制雄激素受體(AR)-PELP1相互作用而發(fā)揮抗癌活性的作用[22]；另有研究證實PELP1作為一個關(guān)鍵的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)協(xié)同調(diào)節(jié)因子在大腦中介導(dǎo)17β-雌二醇(E2)信號和動作，抑制促炎效應(yīng)[5，23]；PELP1也是激素依賴型婦科惡性腫瘤的潛在原癌基因，被確定為胃癌、結(jié)腸癌、食管癌的潛在標(biāo)記物[8，10，24]。雖然PELP1在體內(nèi)的意義仍然不清楚，且肝癌的發(fā)生發(fā)展過程復(fù)雜，分子機制尚待闡明，分子靶向治療是一種新型有效的肝癌治療，目前正處于發(fā)展熱點。

由于PELP1在肝癌中高表達(dá)，但在肝癌的發(fā)生發(fā)展的過程中所扮演的角色尚不清楚，鑒于PELP1在肝癌中的作用，我們探索了潛在的分子機制PELP1沉默調(diào)節(jié)肝癌。最近一項研究提示肝癌中存在雌激素受體，如miR-939-3p與雌激素受體1(ESR1)的潛在結(jié)合靶點[25]。有研究提示，STAT3信號通路在肝癌細(xì)胞中有傳遞信號和啟動基因轉(zhuǎn)錄的作用[26]。PELP1可激活STAT3信號通路，參與腫瘤的增殖分化，轉(zhuǎn)移侵襲等過程。我們目前研究證實，siRNA沉默的PELP1下調(diào)STAT3以及磷酸化STAT3的表達(dá)。總之PELP1可能對肝癌患者的預(yù)后有重要意義。