張 鵬，黃俊潮，屈 亮，張光學(xué)

(湖北科技學(xué)院核技術(shù)與化學(xué)生物學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

隨著全球人口數(shù)量增加及人均壽命的提升，每年因骨折、患病造成骨壞損需要進(jìn)行骨矯正與骨移植手術(shù)的病例呈上升之勢，需要大量的骨修復(fù)材料，常用的材料有自體骨、異體骨、異種骨及人工骨材料4種[1]。從生物學(xué)角度考慮，自體骨是理想的骨移植材料，但從骨來源、手術(shù)給患者造成痛苦的角度考慮也存在不足；雖然異體骨與異種骨可以解決骨來源問題，卻因其存在免疫排異反應(yīng)或傳染疾病的風(fēng)險(xiǎn)也受到了限制。因此，骨移植材料來源就落在人工骨材料方面。

羥基磷灰石(HAP)與磷酸三鈣(β-TCP)都是骨組織的主要成分和骨組織修復(fù)的良好材料，已在臨床醫(yī)學(xué)上得到了廣泛的應(yīng)用[2]。殼聚糖(CS)具有良好的生物相容性、生物可降解性且降解產(chǎn)物可被人體完全吸收，明顯改善材料的力學(xué)性能，促進(jìn)骨細(xì)胞的黏附、增值作用[3]。羧甲基纖維素鈉(CMC)具有可降解、生物相容性及較強(qiáng)的粘結(jié)性[4]。聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PGMA)具有較好力學(xué)性能，但由于表面光滑，骨細(xì)胞附著性、骨傳導(dǎo)性及骨再生修復(fù)功能存在缺陷，所以尋找具有良好的力學(xué)性能、再生修復(fù)作用強(qiáng)的人工骨材料一直是科研工作者追求的目標(biāo)。我們采用CMC、CS、HAP、β-TCP與甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)經(jīng)輻照聚合制備人工材料，現(xiàn)將過程總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

骨水泥材料采用鈷源輻照方法，于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院完成。

主要試劑與儀器：殼聚糖，脫乙酰度90%，BR，國藥集團(tuán)化學(xué)設(shè)計(jì)有限公司；納米HAP：AR，β-TCP：AR，GMA：98%，AR，以上皆購于上海阿拉丁有限公司；人骨肉瘤細(xì)胞(U2OS)，ATCC；1640培養(yǎng)液、緩沖液FBS、青霉素、鏈霉素，皆為Gibco，USA。

X射線衍射儀(X’Pert Pro MPD，Philips，Ducth)；Inspect-F掃描電子顯微鏡(FEI，USA)；萬能材料試驗(yàn)機(jī)(AG10TA，JEOL，Japan)；倒置相差顯微鏡(Olympus，USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)合骨水泥材料的制備

分別配制20% CS與20% CMC凝膠，取混合凝膠(各50%)1g數(shù)份，依次加入0.0、0.1、0.2、0.3、0.4g質(zhì)量(HAP/TCP=1)粉體，與混合凝膠充分?jǐn)嚢杌靹蚝螅糜谀＞咧卸ㄐ?。定型的固體先在50℃真空中48h干燥至恒重，然后讓固體材料整體浸泡液體GMA中；數(shù)天直至恒重取出，將其置于鈷源中輻照，輻照總劑量為14kGy，制成復(fù)合材料，見圖1(封三)。

1.2.2 掃描電鏡觀察

將復(fù)合材料烘干后真空噴金，用掃描電鏡掃描試樣表面，觀察樣品表面形貌，記錄并照相。

1.2.3 X射線衍射分析

采用X射線衍射儀對(duì)HAP、β-TCP、PGMA復(fù)合材料分別進(jìn)行了物相組成分析，分析條件為：電壓35kV，電流25mA，衍射起始角10°，衍射終止角80°，步寬0.06°，波長1.5406 nm。

1.2.4 復(fù)合材料的力學(xué)性能測試

使用萬用材料試驗(yàn)機(jī)對(duì)不同質(zhì)量比復(fù)合材料進(jìn)行抗壓強(qiáng)度測試，于室溫以1mm/min的速度等速加載壓縮，直至樣品破裂或者厚度減少60%。按照公式計(jì)算強(qiáng)度[5]，抗壓強(qiáng)度(MPa)=4Fmax÷πd2，其中Fmax為最大加載力(kg)，d為試件的直徑(mm)。每種樣品測3次，取平均值。

1.2.5 復(fù)合材料細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將材料切成2mm厚，直徑10mm的小塊，置于EP管中121℃高壓滅菌20min；將滅完菌的材料置于12孔板上預(yù)濕，每空一塊材料，每種材料置3孔，并設(shè)3孔為不加材料的空白對(duì)照組；將第三代U2OS細(xì)胞以1×105/孔定量接種在材料上，每孔2mL培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，每天換一次液；培養(yǎng)一周后，用胰蛋白酶EDTA消化吸收細(xì)胞，將細(xì)胞計(jì)數(shù)后求平均值；增值率=(平均細(xì)胞數(shù)-初始細(xì)胞數(shù))/初始細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 X射線衍射分析結(jié)果

從圖2可知，復(fù)合材料中HAP(2θ=32.1°的主峰和33°的次強(qiáng)峰)與β-TCP(2θ=31°的主峰和33.2°的次強(qiáng)峰)的特征衍射峰清晰可見，材料的復(fù)合并沒有改變HAP與β-TCP的結(jié)構(gòu)，其與混合凝膠、PGMA之間的復(fù)合應(yīng)為物理結(jié)合。

圖2 復(fù)合材料的X射線衍射圖譜

2.2 抗壓強(qiáng)度檢測結(jié)果

表1是1.0g混合凝膠中加不同質(zhì)量的粉體(HAP/β-TCP=1∶1)，不加GMA未輻照時(shí)所測定的復(fù)合材料的壓縮強(qiáng)度；1.0g混合凝膠中加不同質(zhì)量的粉體(HAP/β-TCP=1∶1)，浸泡GMA輻照聚合后所測定的復(fù)合材料的壓縮強(qiáng)度，所得結(jié)果明顯高于不加GMA未輻照的復(fù)合材料。

表1 添加不同質(zhì)量粉體復(fù)合材料的力學(xué)性能表

2.3 掃描電鏡觀察結(jié)果

1g質(zhì)量混合凝膠中加0.3g粉體(HAP/β-TCP=1∶1)掃描電鏡觀察。圖3a為放大10k倍，未加GMA不輻照，材料中空隙較大，其原因是材料干燥過程中凝膠中的溶劑揮發(fā)所致。圖3b放大10k倍，加GMA輻照的材料中可以看見縫隙明顯降低，其原因是材料浸泡了一定量的GMA，經(jīng)鈷源輻照生成了聚合物PGMA，降低了材料中的空隙。

圖3 復(fù)合材料的掃描電鏡觀察圖(10k倍)

2.4 U2OS細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

表2是人肉瘤骨細(xì)胞培養(yǎng)7d的細(xì)胞增殖情況。從表中可知，復(fù)合材料有利于細(xì)胞增殖。圖4(封三)為倒置顯微鏡觀察U2OS細(xì)胞形態(tài)，A-C為殼聚糖與HAP和β-TCP比例為0.1、0.2、0.3復(fù)合材料浸提液中的細(xì)胞，D為陰性對(duì)照組，細(xì)胞在不同比例的復(fù)合材料浸提液中生長良好，與陰性對(duì)照組沒有差別。

表2 細(xì)胞相對(duì)增值率對(duì)照表

3 討 論

上述復(fù)合材料經(jīng)真空干燥后，材料中的溶劑分子將會(huì)逸出一部分留下空隙，將其放于GMA中浸泡，GMA慢慢滲透到材料空隙中。將浸泡的材料于60Coγ射線輻照，GMA轉(zhuǎn)化生成PGMA凝膠，進(jìn)一步降低材料中的空隙，因而復(fù)合材料壓縮強(qiáng)度得到了進(jìn)一步的提高。

由于混合凝膠為CS與CMC，CS與CMC在組織體液中長時(shí)間浸泡，CS與CMC就會(huì)發(fā)生降解和溶解，導(dǎo)致材料的力學(xué)性能迅速下降；而骨組織再生修復(fù)過程是一個(gè)比較緩慢的過程，所需時(shí)間要達(dá)數(shù)月甚至更長。為充分保證復(fù)合材料高強(qiáng)度力學(xué)性能，避免給患者二次手術(shù)造成痛苦；將材料添加GMA進(jìn)行輻照，增加疏水性的PGMA高分子聚合物。一方面可以進(jìn)一步提高材料的壓縮強(qiáng)度，另一方面可以延緩CS與CMC降解和溶解的速度，骨組織進(jìn)行再生修復(fù)時(shí)，骨材料的力學(xué)性能不會(huì)迅速下降。

由于HAP具有良好的生物相容性，與骨組織成分相似，目前骨外科矯形材料應(yīng)用較多，HAP的強(qiáng)度不高且難以降解，不利于骨組織的再生與修復(fù)。為尋找優(yōu)異性能的骨移植材料，很多學(xué)者[2-6]采用CS、CMC復(fù)合的方法。TCP強(qiáng)度不高，在體內(nèi)代謝生成Ca2+、 PO43-，被骨組織吸收，促進(jìn)骨組織的再生與修復(fù)。CS是天然高分子聚合物，具有消炎、殺菌、生物體內(nèi)易降解及良好的生物相容性而廣泛用于生物復(fù)合材料。圖4的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明，復(fù)合材料有利于細(xì)胞的附著與增殖；利用CS、CMC易于降解之特性，其降解所留下來的孔隙，將有利于骨細(xì)胞體液的傳導(dǎo)，更好地促進(jìn)骨組織再生與修復(fù)。

為解決骨外科矯形材料力學(xué)性能不足，目前較多的是用高分子聚合物聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)進(jìn)行復(fù)合[7]，而PGMA的結(jié)構(gòu)與PMMA非常相似，用作生物材料也未見文獻(xiàn)報(bào)道；采用輻照法合成PGMA高分子聚合物，操作簡便易行，可以根據(jù)所需矯正骨的形狀設(shè)計(jì)相應(yīng)的模具，再將復(fù)合材料加到模具中即可制成不同形狀骨組織材料。本次抗壓強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，隨著粉體量的增加，復(fù)合材料的力學(xué)性能呈先增后降趨勢，實(shí)驗(yàn)中加入0.2、0.3g粉體所制備的復(fù)合材料皆在180MPa以上，完全可以滿足骨組織替代材料力學(xué)性能的要求。U2OS為人骨肉瘤組織中分離的細(xì)胞，對(duì)化合物及病毒極其敏感，已廣泛用于體外生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)[8]；表2與圖4的細(xì)胞形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，所制備的復(fù)合材料具有良好的生物相容性。

總之，采用輻照方法合成PGMA高分子聚合物，能將CS、CMC、HAP/β-TCP粉體很好的融合為一體，方法簡便、生物相容性好，既滿足了骨材料力學(xué)性能的要求，又兼顧了骨組織再生修復(fù)，有望成為骨外科矯形材料一種新的合成方法。