董志斌，王煜嘉，李 岱，朱海麗

(湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

脊髓炎性痛是脊髓受損后常見的癥狀之一，導(dǎo)致脊髓炎的因素很多，包括脊髓損傷、感染及自身免疫性疾病等[1]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞兩者是結(jié)構(gòu)和功能伙伴關(guān)系，在應(yīng)對傷害或疾病時共同起作用。生理狀態(tài)下星形膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息態(tài)；病理性疼痛(包括神經(jīng)痛、炎性痛和骨癌痛)狀態(tài)下，脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活，釋放促炎因子并維持疼痛[2]。

NLRP3炎癥小體在炎癥因子的加工和釋放中起著關(guān)鍵作用，如白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和IL-18[3]。NLRP3炎癥小體由NOD樣受體3(NOD-like receptor 3，NLRP3)、接頭蛋白凋亡相關(guān)點(diǎn)狀樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和效應(yīng)蛋白半膚氨酸蛋白酶1前體(pro-caspase-1)組成。NLRP3炎癥小體介導(dǎo)pro-caspase-1活化為caspase-1，進(jìn)而導(dǎo)致IL-1β和IL-18的成熟和釋放，發(fā)揮免疫炎癥效應(yīng)[4]。

2-溴棕桐酸(2-Bromopalmitate，2-BP)可影響蛋白質(zhì)在膜結(jié)構(gòu)上的定位及功能，是一種常用的蛋白棕桐?；种苿5]。本研究明確了鞘內(nèi)給藥2-BP對脊髓炎性痛的緩解作用，并探討其病理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

本實(shí)驗(yàn)中使用的Sprague-Dawley(SD)大鼠購于湖北省實(shí)驗(yàn)動物中心，共18只，體質(zhì)量180～200g，6～8周齡。動物合格證號：No.42000600041944。

1.2 主要試劑

二甲基亞砜(DMSO)、2-BP、蛋白酶抑制劑均購自美國Sigma公司，加強(qiáng)型RIPA lysis buffer、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、TNF-α均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Anti-NLRP3(A12694)、anti-β-actin(A1978)、anti-ASC(A11433)、anti-caspase-1(A0964)、anti-GFAP(A19058)、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.3 模型建立及分組處理

構(gòu)建大鼠脊髓炎性痛模型，方法如下[6]：剔除大鼠背部注射部位毛發(fā)并進(jìn)行皮膚表面消毒，用無菌微量注射器于L5和L6脊椎棘突間隙垂直進(jìn)針，進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，緩慢傾斜45°注入100ng/10μL TNF-α，構(gòu)建脊髓炎模型大鼠(建模組)，分為模型組(n=6)及模型給藥組(n=6)；對照組大鼠注射同等體積生理鹽水，分為空白對照組(n=3)和對照給藥組(n=3)。隨后所有大鼠，注入TNF-α或生理鹽水半小時后，模型組和空白對照組鞘內(nèi)注射10μL體積DMSO+生理鹽水(體積比1∶1)，模型給藥組和對照給藥組注射200μg/10μL體積的2-BP溶液。2-BP溶解在DMSO中,使用前用生理鹽水按體積比1∶1進(jìn)行稀釋。

1.4 大鼠自發(fā)性縮足反射次數(shù)記錄

大鼠置于長寬高均為30cm的透明有機(jī)玻璃盒內(nèi)，玻璃平板位于實(shí)驗(yàn)平臺高50cm的支架上。實(shí)驗(yàn)開始前，將大鼠放置玻璃盒中適應(yīng)30min，觀察并記錄每5min內(nèi)大鼠自發(fā)性縮足(或舔爪)反射次數(shù)，記錄3次。建模成功的基礎(chǔ)上建模組和對照組分別放回盒內(nèi)30min后記錄縮足(或舔爪)次數(shù)/5min，記錄3次。進(jìn)而，繼續(xù)鞘內(nèi)注射DMSO+生理鹽水(模型組和空白對照組)或2-BP(模型給藥組和對照給藥組)，30min后記錄縮足(或舔爪)次數(shù)/5min，記錄3次。

1.5 免疫印跡法檢測脊髓組織GFAP、NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達(dá)水平

空白對照組、模型組和模型給藥組大鼠行為學(xué)記錄結(jié)束后，給予過量麻醉(10%水合氯醛5mL/kg)處死，分離脊柱，暴露脊髓，剝離脊膜，分離并得到腰段脊髓，進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP，炎癥小體標(biāo)記蛋白NLRP3、ASC、caspase-1的表達(dá)水平。具體過程如下：脊髓組織加入含有酶抑制劑的RIPA裂解液勻漿，12 000r/min、4℃離心15min取上清，BCA蛋白分析試劑盒檢測上清中的蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉lh，一抗孵育過夜，二抗孵育1h，LAS500凝膠成像系統(tǒng)掃描觀察，Image J軟件對比分析空白對照組、模型組和模型給藥組的條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 成功構(gòu)建大鼠脊髓炎性痛模型

以大鼠自發(fā)性縮足(或舔爪)反射次數(shù)(Flinches)評估大鼠自發(fā)性痛情況。如圖1所示，與對照組相比，注射TNF-α后建模組縮足次數(shù)明顯上升(P<0.05)，表明脊髓鞘內(nèi)注射TNF-α引發(fā)大鼠外周痛覺過敏建模成功。

與對照組比較，*P<0.05

2.2 2-BP鞘內(nèi)給藥緩解大鼠脊髓炎性痛

為了檢測2-BP對脊髓炎性痛的作用，鞘內(nèi)給藥2-BP后記錄大鼠自發(fā)性縮足(或舔爪)反射次數(shù)。如圖2顯示，模型給藥組大鼠的自發(fā)縮足次數(shù)明顯降低(P<0.05)。同時，對照組中2-BP對正常大鼠的行為學(xué)沒有影響(P>0.05)。該結(jié)果表明鞘內(nèi)給藥2-BP可有效緩解脊髓炎引發(fā)的痛覺過敏。

與模型組比較，*P<0.05

2.3 2-BP降低GFAP蛋白表達(dá)水平

如圖3所示，與空白對照組相比，模型組大鼠脊髓組織中GFAP的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。2-BP給藥處理后，脊髓中GFAP的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。表明2-BP鞘內(nèi)給藥顯著降低GFAP的蛋白表達(dá)水平，降低星形膠質(zhì)細(xì)胞過度激活。

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.4 2-BP抑制NLRP3炎癥小體活化

為驗(yàn)證2-BP對炎癥反應(yīng)的影響，我們檢測了NLRP3炎癥小體變化水平，包括核心蛋白NLRP3、銜接蛋白ASC和效應(yīng)蛋白caspase-1的表達(dá)，其中pro-caspase-1表征caspase-1的本底表達(dá)水平，cleaved-caspase-1表征caspase-1的活化水平。免疫印跡結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組大鼠脊髓組織中NLRP3、ASC以及cleavad-caspase-1蛋白表達(dá)均增加(P<0.05)。但2-BP給藥后NLRP3、ASC以及cleavad-caspase-1的表達(dá)水平均明顯下調(diào)(P<0.05)。上述數(shù)據(jù)表明，鞘內(nèi)給藥2-BP顯著抑制NLRP3炎癥小體活化，從而降低脊髓炎癥。

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3 討 論

本研究以大鼠脊髓炎模型為研究載體，探究2-BP對脊髓炎引發(fā)外周痛覺過敏的作用以及相關(guān)機(jī)制。脊髓組織是小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞主要分布區(qū)域，當(dāng)誘導(dǎo)脊髓炎癥時，這些細(xì)胞均會發(fā)生炎癥激活及代謝異常導(dǎo)致疼痛[7]。GFAP是scar-星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，反映星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性[8]。脊髓炎癥包含有多種炎性蛋白參與其形成，由于細(xì)胞代謝異常啟動炎癥NLRP3小體形成，繼而促進(jìn)接頭蛋白指向ASC及caspase-1蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)脊髓神經(jīng)細(xì)胞的損傷引起脊髓炎癥性疼痛。在炎性因子誘導(dǎo)的脊髓炎模型中，2-BP給藥后，脊髓組織中GFAP表達(dá)明顯降低，表明2-BP可有效降低星形膠質(zhì)細(xì)胞激活。

星形膠質(zhì)細(xì)胞激活可引發(fā)炎性蛋白及炎癥的形成，NLRP3炎癥小體是影響炎癥因子表達(dá)活化的重要調(diào)節(jié)因素[9]。靜息狀態(tài)下 NLRP3 位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，病理狀態(tài)被激活后，NLRP3和其配體ASC聚集到細(xì)胞核周圍，誘導(dǎo)pro-caspase-1轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腸leavage-caspase-1，進(jìn)一步切割pro-IL-1β和pro-IL-18，將其轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩锘钚缘腎L-1β和IL-18，并釋放到細(xì)胞外組織中，參與后續(xù)的炎癥瀑布反應(yīng)，強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致脊髓中的神經(jīng)元死亡[10]。為表征2-BP對炎癥小體的作用，如圖4所示，我們發(fā)現(xiàn)2-BP顯著降低NLRP3、ASC和cleavage-caspase-1的蛋白表達(dá)，表明2-BP可抑制NLRP3炎癥小體活化，

降低星形膠質(zhì)，最終發(fā)揮緩解脊髓炎性痛的作用。

綜上所述，2-BP可能通過調(diào)節(jié)炎性小體NLRP3在小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞中合成，進(jìn)而改善藥物誘導(dǎo)動物的炎性疼痛，同時該研究也為2-BP在抗炎鎮(zhèn)痛中的作用提供了一定的理論依據(jù)。