趙亞琴，徐倞倞，李曉瑾*，樊叢照，朱軍，王果平

1.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002；

2.國家中醫(yī)藥管理局 新疆中藥民族藥資源重點研究室，新疆 烏魯木齊 830002；

3.新疆農業(yè)大學，新疆 烏魯木齊 830052

阿魏應用歷史悠久，為漢族、維吾爾族、蒙古族、藏族等各民族傳統(tǒng)醫(yī)用藥之一?，F(xiàn)代藥理學研究表明，阿魏具有抗生育、免疫抑制、解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等廣泛的藥理活性，近年來因發(fā)現(xiàn)其具有植物雌激素活性成分和抗癌活性物質而備受關注[1]。新疆阿魏Ferula sinkiangensisK.M.Shen 是僅產于新疆的道地藥材，具有多年生早春短命植物特性，日益增長的市場需求致使該物種瀕臨滅絕[2]，因此尋找新疆阿魏替代資源具有重要意義。

植物內生真菌（endophytic fungi）是指部分或者全部時期生活在植物體內，而不會引起宿主植物產生明顯病害癥狀的一類真菌，在與宿主植物共生的漫長過程中與宿主植物建立起了互利互惠的關系。其種類豐富，次級代謝活躍，不僅能產生一些結構獨特、骨架新穎的活性化合物，而且這類化合物生物活性較強[3]。多項研究表明，植物內生菌代謝產物含有與宿主植物相同或相似的有效成分，從內生真菌分離得到的活性物質中有50%以上是新化合物且抗癌活性顯著，為臨床應用提供了新的藥物來源[4]。

基于植物內生真菌能夠產生與宿主相同或相似的活性成分，本研究對前期已分離獲得的117株新疆阿魏內生真菌提取物進行抗腫瘤活性體外篩選與評價，以期尋找具有產生抗腫瘤活性物質潛力的菌株，對挖掘和拓寬阿魏資源及新型抗癌活性物質的研究提供參考。

1 材料

1.1 菌株

117 株菌種源自傘形科植物新疆阿魏Ferula sinkiangensisK.M.Shen 的內生真菌，保藏于新疆中藥民族藥研究所實驗室菌種庫，由于菌株保密原因，其名稱尚未公開。

1.2 細胞

人宮頸癌HeLa 細胞和胃癌AGS 細胞均由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所天然藥物研究中心化學室主任斯建勇教授惠贈，由實驗室傳代保存。其中，HeLa 細胞使用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，AGS 細胞使用Ham′s F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 試藥與儀器

馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基（批號：P8931，北京索萊寶科技有限公司）；高糖DMEM 培養(yǎng)基（批號：12100-046，美國Invitrogen 公司）；Ham′s F12 培養(yǎng)基（批號：SH30026.01B，美國Hyclone 公司）；胎牛血清（批號：70220-8611，浙江天杭生物科技有限公司）；胰蛋白酶和青鏈霉素混合物（批號：25200-056，美國Gibco 公司）；二甲基亞砜（DMSO，批號：0231，美國Amresco 公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，批號：P1022，北京索萊寶科技有限公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，批號：298-93-1，美國Sigma 公司）；SA-1500-1 型（SHJ 系列）超凈工作臺（上海上凈凈化設備有限公司）；Sorvall legend Micro 17 型高速離心機、Fomia-86C991 型低溫冰箱（美國Thermo 公司）；CKX41SF 型倒置光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；JJ200 型電子分析天平（上海精科儀器有限公司）；MLS-3750 型全自動高壓滅菌鍋（日本Sanyo 公司）；MQX200 型酶標儀（美國BioTek 公司）；QL-901 型96 孔培養(yǎng)板（美國Corning公司）。

2 方法

2.1 凍存菌株的復蘇純化與發(fā)酵粗提取

將本課題組前期分離鑒定的內生真菌菌株活化，利用PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得供試內生真菌提取物[5]。菌株接入培養(yǎng)基中，于25 ℃、180 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)15 d；濾過，分別收集培養(yǎng)液與菌絲體；培養(yǎng)液旋蒸后得到浸膏，編號為1～117；菌絲體用甲醇回流提取，旋蒸，回收甲醇，得到菌絲體醇提浸膏117 份，編號為118～224（10 份菌絲體浸膏難以溶解未編入受試樣品，菌株編號為2661/6852、2694/7253、2604/7251、2692/6826、2645/7250、2582/6614、2692/6836、2633/6835、501/3340、2584/6636）。

2.2 供試品制備

供試母液用DMSO 配制，分別稱取供試品（含菌絲體提取物、培養(yǎng)液體提取物）500 μg 于離心管中，加DMSO 500 μL，超聲助溶后置于4 ℃冰箱備用。

2.3 MTT法檢測提取物抗腫瘤活性

2.3.1 提取物對HeLa、AGS細胞增殖的影響 HeLa、AGS細胞以5×104個/mL接種于96孔板，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 至長滿單層。加入終質量濃度為100 μg·mL-1受試樣品100 μL[6-7]，每個樣品設3 個復孔，設置調零孔（只加培養(yǎng)基）、溶劑對照組（加入終體積分數(shù)為0.1%的DMSO）。培養(yǎng)48 h 后，加MTT（5 mg·mL-1）溶液20 μL 避光孵育4 h，棄去，每孔加DMSO 150 μL 振蕩溶解，490 nm 波長條件下測吸光度（A）值，計算每個樣品3 個復孔A值的平均值，按公式（1）計算不同質量濃度提取物對HeLa、AGS 細胞的增殖抑制率（IR）。

2.3.2 有效樣品的半數(shù)抑制濃度（IC50）測定 以抑制率>50%為標準，篩選具有明顯的腫瘤細胞增殖抑制活性的提取物，采用MTT 法（受試樣品質量濃度從200 μg·mL-1起，2倍比稀釋供試提取物）測定有效樣品的IC50。

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計分析軟件的t檢驗進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)用（）表示。

3 結果

3.1 新疆阿魏內生真菌提取物對HeLa、AGS 細胞增殖的影響

結果表明，在質量濃度為100 μg·mL-1時，以抑制率大于50%為標準，得到有抑制腫瘤細胞增殖活性的樣品49 份（表1），占受試菌株的36.7%。其中菌液提取物12 份、菌絲體提取物37 份；有6 株菌（編號分別為2618/6821、2596/6643、465/N190、2571/6657、487/3322、439/N158）的菌液提取物及菌絲體提取物對腫瘤細胞的增殖均具有顯著抑制作用；15 份樣品對2 種細胞均具有明顯的抑制作用（圖1）。

圖1 15個新疆阿魏內生真菌提取物對AGS和HeLa細胞增殖的抑制率（,n=3）

表1 阿魏內生真菌提取物對2種腫瘤細胞增殖的影響

3.2 有效樣品的IC50測定結果

結果顯示，1938/TL168號菌株對HeLa細胞抑制作用最強，IC50為（25.95±3.39）μg·mL-1；2682/6626號菌株提取物次之，IC50為（30.53±2.84）μg·mL-1。對AGS 細胞抑制作用最強的是2690/7242 號菌株，IC50為（32.17±2.47）μg·mL-1（表2）。

表2 新疆阿魏內生真菌提取物對AGS和HeLa細胞的IC50（,n=3）μg·mL-1

表2 新疆阿魏內生真菌提取物對AGS和HeLa細胞的IC50（,n=3）μg·mL-1

4 討論

4.1 新疆阿魏內生真菌具備開發(fā)為抗腫瘤新藥的潛質

植物內生真菌通過與植物交換基因，可以產生與宿主相同或相似的化合物，現(xiàn)已成為天然活性物質的重要資源庫之一[8]。本團隊前期對新疆阿魏不同部位提取物進行體外抗腫瘤活性研究，發(fā)現(xiàn)新疆阿魏樹膠和種子的脂溶性部分對人胃癌、宮頸癌等細胞增殖具有顯著的抑制作用[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，新疆阿魏內生真菌可有效抑制胃癌、宮頸癌等癌細胞的體外增殖，亦證實了內生真菌可以產生與其宿主相關的活性物質?！秶倚滤帲ㄎ魉帲┡R床前研究指導原則匯編》規(guī)定，體外抗腫瘤效果的評價以體外IC50表示，當植物提取物對腫瘤細胞增殖的IC50≤30 μg·mL-1，即被認為體外具有抗腫瘤活性[11]，新疆阿魏內生真菌編號為1938/TL168 的菌株提取物對HeLa 細胞增殖的IC50為（25.95±3.39）μg·mL-1，表明阿魏內生真菌提取物符合抗腫瘤藥物體外篩選標準，可為新型抗腫瘤藥物的研發(fā)提供新來源，具備開發(fā)為抗腫瘤新藥的潛質。

4.2 新疆阿魏不同種屬的內生真菌抗腫瘤活性存在較大差異

供篩的117 株阿魏內生真菌中具有抑制腫瘤細胞增殖活性的菌株有43 株，主要歸屬于鏈格孢屬（Alternariasp.）。鏈格孢屬在植物中分布較為廣泛，從該屬的內生真菌中分得的生物堿（如長春堿、細胞松弛素等）、萜類（如紫杉醇）、黃酮類等化合物具有較強的抗腫瘤活性，是一類具有抗癌應用潛力的生物資源[12-14]。而本研究中相關內生真菌發(fā)揮抗腫瘤活性的物質基礎具體是什么，是否與其宿主阿魏抗腫瘤活性成分一致等問題有待進一步研究；同時，研究發(fā)現(xiàn)阿魏內生真菌不同種屬提取物之間的抗腫瘤活性存在較大差異，而同一菌株的提取物對不同腫瘤細胞的增殖抑制作用也存在差異，這些作用的差異可能與不同種屬提取物中化學成分結構的多樣性有關。

4.3 新疆阿魏內生真菌的培養(yǎng)條件和提取方式與其抗腫瘤活性相關

研究結果顯示，雖然2682/6626號菌株的菌液提取物對HeLa細胞的IC50為（30.53±2.84）μg·mL-1，但在所有受試提取物篩選結果中，菌絲體提取物的腫瘤增殖抑制作用效果明顯優(yōu)于菌液提取物，說明內生真菌活性成分的積累、釋放可能與菌株所處的溫度、光照、終止培養(yǎng)時間等外在因素密切相關，其產生與作用機制尚需進一步研究。如何大批量培養(yǎng)能穩(wěn)定產生抗腫瘤活性物質的提取物將是今后研究的一個重要方向。