繆宇鋒 張有為 焦南林

1.浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，浙江溫嶺 317500；2.江蘇省徐州市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇徐州 221009；3.皖南醫(yī)學院附屬弋磯山醫(yī)院病理科，安徽蕪湖 241001

胰腺癌是消化系統(tǒng)惡性程度最高的腫瘤，主要病理類型為胰腺腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD），5 年生存率約為5%[1-2]。由于胰腺癌起病隱匿，早期癥狀不典型，大多數(shù)患者確診時已屬晚期；并且，進展到晚期的胰腺癌缺乏有效治療手段，導致其發(fā)病率與病死率相近，預后極差[3]。PAAD 發(fā)病機制尚未明確，家族遺傳性、吸煙、慢性胰腺炎及糖尿病等因素均被證實與之相關(guān)[4]。因此，深入探索PAAD 發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵基因，對于進一步明確其發(fā)病機制，提高早期診斷及評估預后具有重要意義。

FAM83D 是FAM83 家族成員，定位于人類20q 染色體，編碼紡錘體相關(guān)的蛋白，被認為與有絲分裂密切相關(guān)[5-6]。既往研究[7-10]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83D 在多種癌癥如卵巢癌、肝癌及肺癌中表達上調(diào)，并參與調(diào)節(jié)癌細胞增殖、侵襲和遷移，可能成為新型腫瘤分子標志物。然而，F(xiàn)AM83D 在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚未明確，本研究基于在線數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)性分析FAM83D 基因在PAAD 的表達及預后意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

60 對PAAD 術(shù)后組織標本來自2018 年1 月至2019 年12 月皖南醫(yī)學院附屬弋磯山醫(yī)院病理科的存檔蠟塊，包括癌組織與癌旁組織（距離腫瘤>2 cm 的胰腺組織），所有患者病理學診斷明確，術(shù)前均未接受放化療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準并取得所有患者知情同意。

1.2 生物信息學分析

基因表達譜動態(tài)分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）工具（http://gepia2.cancerpku.cn）在線分析FAM83D 基因在PAAD 的表達及預后，參數(shù)設(shè)定：Log2FC Cutoff=1，p-value Cutoff=0.01。其中腫瘤組織（n=179）信息來源于TCGA 數(shù)據(jù)庫，正常組織（n=171）信息源于TCGA 數(shù)據(jù)庫和GTEx數(shù)據(jù)庫。驗證數(shù)據(jù)集來自KMplot 數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com/analysis/）。

1.3 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）

采用GSEA 將RNAseq Gene 數(shù)據(jù)中胰腺癌組織樣本分為FAM83D mRNA 高表達組和低表達組（基于FAM83D mRNA 表達的中位數(shù)值作為Cutoff 值），分析預測靶基因可能參與的信號通路。參照基因集為MsigDB 中的c2.all.v5.0.symbols.gmt，將其導入GSEA 4.0.3 軟件中進行通路富集分析，軟件設(shè)置按照默認參數(shù)，樣本置換檢驗1000 次，F(xiàn)DR<0.05 作為差異顯著性的評價標準。

1.4 免疫組織化學染色（immunohistochemistry，IHC）

調(diào)取蠟塊，以4 μm 厚切片，脫蠟水化，3% H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶室溫10 min，PBS 沖洗，高溫高壓抗原修復，PBS 再沖洗，滴加Anti-FAM83D 一抗（Abcam 中國，1∶100 稀釋），4℃過夜，PBS 沖洗后二抗室溫孵育30 min，PBS 沖洗，DAB 顯色，流水沖洗10 min，蘇木精復染，脫水、透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察。FAM83D 陽性染色位于細胞漿，IHC 評分根據(jù)染色強度和陽性細胞數(shù)來判定，評分標準參照文獻[11]。

1.5 統(tǒng)計學方法

通過對維生素B1缺乏癥的治療以及預防，減少了動物的死亡率，節(jié)約了養(yǎng)殖成本，降低了因維生素B1缺乏引起的各種神經(jīng)及心血管癥狀，能直接提供動物所需的硫胺素，從而達到預防和治療的目的。

2 結(jié)果

2.1 FAM83D 在PAAD 中的表達情況

與FAM83D mRNA 低表達組比較，F(xiàn)AM83D mRNA高表達組總生存期、無進展生存期明顯縮短（P<0.01），見圖2A～B；并且在KMplot 數(shù)據(jù)庫中得到進一步驗證，見圖2C～D。

綜上所述，通過對腦卒中偏癱患者進行呼吸肌反饋訓練，可以有效地改善患者的呼吸功能障礙，呼吸功能的改善促進了患者的吞咽，患者吞咽功能的改善又進一步改善了患者的呼吸功能，呼吸功能改善與吞咽功能改善就形成了一種良性循環(huán)。并且該訓練方法簡單有效，可以在臨床推廣應(yīng)用呼吸肌反饋訓練儀對腦卒中偏癱患者進行呼吸功能的訓練。但本研究也存在局限性，比如樣本量小，訓練時間不夠長，同時未對呼吸功能改善與吞咽障礙功能改善的相關(guān)性進行進一步探究。以后的研究中會加大樣本量，延長訓練時間并進一步探究呼吸功能與吞咽功能之間的關(guān)系。

表1 FAM83D 蛋白表達與PAAD 臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

圖1 FAM83D 在PAAD 中的表達情況

2.2 FAM83D mRNA 表達與PAAD 患者預后的關(guān)系

GEPIA 在線分析顯示，與正常組織比較，腫瘤組織中FAM83D mRNA 表達明顯升高（P <0.01），見圖1A。組織標本分析顯示，65.0%（39/60）癌組織中FAM83D 蛋白水平為高表達（IHC 評分≥3 分），而36.7%（22/60）癌旁組織中FAM83D 蛋白水平為高表達；與癌旁組織比較，癌組織IHC 評分顯著增高（P <0.01），見圖1B～C。進一步分析臨床病理參數(shù)，PAAD 患者FAM83D 蛋白高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P ＜0.05），與性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑、分化程度、TNM 分期無關(guān)（P >0.05），見表1。

采用SPSS 16.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；FAM83D表達與患者預后的關(guān)系采用Kaplan-Meier生存分析，生存期比較采用Log-rank 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

我國銀行進行信貸業(yè)務(wù)風險分析時，主要方法還是以客戶自身信用情況分析為主，對企業(yè)所屬產(chǎn)業(yè)的風險評價重視程度不夠，雖然已經(jīng)有一些銀行著手將產(chǎn)業(yè)風險分析結(jié)合到風險管理工作當中，但對其的認識依舊不夠深入，當前的產(chǎn)業(yè)風險評價體系還存在著許多問題。

中風屬于常見的急性腦血管疾病，存在起病突然的特點，且發(fā)生局部灶性神經(jīng)功能發(fā)生缺失，患病之后合并發(fā)生多種并發(fā)癥[1] ，其中吞咽功能障礙較為常見。

圖2 FAM83D mRNA 表達與PAAD 患者預后的關(guān)系

2.3 FAM83D 基因潛在作用機制

FAM83D 上調(diào)與多個基因集呈正相關(guān)（P <0.05），如BIDUS_METASTASIS_UP、KEGG_CELL_CYCLE、HALLMARK_GLYCOLYSIS、HALLMARK_DNA_REPAIR、REACTOME_SIGNALING_BY_WNT、JAIN_NFKB_SIGNALING。見圖3。

圖3 GSEA 分析FAM83D 基因潛在作用機制

3 討論

近年來，伴隨著高通量測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用以及數(shù)據(jù)共享機制的不斷成熟，以TCGA 和GEO 為代表的國際公共數(shù)據(jù)庫中積累了大規(guī)模的多組學腫瘤數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)驅(qū)動型研究逐漸成為腫瘤生物信息學研究的重要模式[12]。本研究以腫瘤公共數(shù)據(jù)庫和相應(yīng)的生物信息學技術(shù)為基礎(chǔ)，通過數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)，與正常組織比較，腫瘤組織中FAM83D mRNA 表達顯著升高；IHC結(jié)果顯示癌組織中FAM83D 蛋白呈高表達，且FAM83D蛋白高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。提示FAM83D 可作為PAAD 診斷與預后的潛在分子標志物。

FAM83 基因家族共享一個高度保守的N-末端（DUF1669）[13-14]，此結(jié)構(gòu)域不僅具有一定的磷脂酶D 活性以激活表皮生長因子受體（EGFR）[15-16]，還可促進c-Raf 激酶的膜轉(zhuǎn)位激活MAPK 信號通路[17]，參與調(diào)控上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)變。目前研究[18-21]顯示，F(xiàn)AM83D在不同類型的腫瘤中均存在擴增或過表達，但其作用機制尚未明確。FAM83D 上調(diào)通過激活Wnt/β-catenin信號傳導增強細胞增殖和運動能力，與胃癌的預后不良有關(guān)[22]；FAM83D 通過調(diào)節(jié)非小細胞肺癌的AKT/mTOR 途徑促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，侵襲和順鉑耐藥[23]；FAM83D 通過PI3K/AKT/mTOR 途徑抑制自噬并促進卵巢癌細胞的增殖和侵襲[24]；敲除FAM83D 通過抑制FBXW7/Notch-1 信號傳導途徑調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的增殖，遷移和侵襲[25]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AM83D 上調(diào)與多個基因集呈正相關(guān)，如BIDUS_METASTASIS_UP、KEGG_CELL_CYCLE、HALLMARK_GLYCOLYSIS、HALLMARK_DNA_REPAIR、REACTOME_SIGNALING_BY_WNT、JAIN_NFKB_SIGNALING。提示FAM83D 參與調(diào)節(jié)細胞轉(zhuǎn)移、細胞周期、糖酵解、DNA 修復等生物學過程以及WNT、NF-κB 信號通路，具體尚需進一步研究。

綜上所述，本研究基于在線數(shù)據(jù)庫的深入挖掘，證實FAM83D 基因在PAAD 發(fā)生發(fā)展中的重要作用，為進一步實驗研究提供了理論依據(jù)。