王 格，楊 萌，楊明月，魯 琳＊

1 北京農學院動物科學技術學院，北京 101300

2 農業(yè)農村部華北都市農業(yè)重點實驗室，北京 102206

0 引言

固定化微生物技術（Imobilized Microorganlsins）是20世紀60年代在固定化酶技術的基礎上發(fā)展起來的一項新技術，隨著遺傳工程、細胞工程、酶催化工程等高新技術的成熟發(fā)展和促進，目前已成為生物工程領域的一個重要分支[1]。固定化微生物具有微生物密度大、反應速度快、低污泥產量、耐環(huán)境沖擊和反應過程容易控制等優(yōu)點，吸引眾多國內外學者對其研究。相較于固定化酶技術，固定化細胞技術有其獨特的優(yōu)勢，也使得固定化細胞技術能夠迅速發(fā)展及完善[2]。

一般載體會選擇顆粒小、疏松、比表面積大并且pH值為中性（不足中性的用前調整到中性）的物質。載體不僅對于一定時間內維持菌劑中特定的微生物的活性、數(shù)量有十分重要的作用，還是決定菌劑質量的重要因素之一，將影響應用效果。但是即便采用相同的培養(yǎng)基和相同單位數(shù)量的載體，若固定化的方法不同，菌體與載體的結合方式以及結合程度也將會有所不同。因此，雖然能夠作為載體的材料很多，但并非隨便一種物質都可以作為菌劑載體的材料。據(jù)研究報道[3，4]，載體的種類、數(shù)量、大小、結構、形狀等物理性質和結構特征對白腐真菌的培養(yǎng)及應用均有較大的影響作用。

吸附法是將細胞直接吸附于惰性載體上，分為物理吸附法和離子結合法。物理吸附法是利用硅藻土、多孔磚、木屑等材料作為載體，將微生物細胞吸附?。浑x子結合法是利用微生物細胞表面的靜電荷在適當條件下可以為離子交換樹脂進行離子結合和吸附制成固定化細胞。吸附法的優(yōu)點是操作簡便、載體可再生；缺點是細胞與載體的結合力弱，pH值和離子強度等外界條件的變化都可以導致細胞的解吸，使其從載體上脫落。

一部分學者認為在堆肥過程中沒有必要接種菌劑，但還有大多數(shù)人認為，在人工條件下通過接種菌劑可以提高堆肥的微生物數(shù)量并加快堆肥反應進程。且早在20世紀40年代，美國就通過接種細菌從而使堆肥時間縮短了1～3 天。許多研究結果也充分肯定了接種菌劑在堆肥過程中的促進作用，所以，有不少學者已開始著力研究在堆肥不同階段起關鍵作用的微生物，并開始進行自然界中的優(yōu)質高效菌群的篩選以及接種技術的探討。

本試驗從不同發(fā)酵狀態(tài)的廢棄物中篩選獲得的、纖維素酶活性較高的自選菌種，進行了單載體的吸水率、吸菌量，菌劑固定后的過氧化氫酶和纖維素酶的變化研究，為后續(xù)復合載體吸附微生物的試驗提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本課題組保存，從不同發(fā)酵狀態(tài)的廢棄物中篩選獲得的纖維素酶活性較高的自選菌種：真菌ZZ9、細菌ZX5及ZH9。

載體：麥麩（MF）、鋸末（JM）、干牛糞（GNF）、硅藻土（GZT）、蛭石（ZS）、珍珠巖（ZZY）、草炭（CT）。

1.2 試驗儀器

滅菌鍋、超凈工作臺、-80 ℃冰箱、搖床、培養(yǎng)箱、烘箱。

1.3 試驗方法

1.3.1 單載體的吸水量測定

在無菌條件下將菌液與各載體充分混勻，每次加入5.0 mL菌液。使載體濕潤，并保持疏松，且不結塊。以菌劑所含的菌液量為載體吸水率，吸水率反映載體的吸附能力。

1.3.2 單載體的吸菌量測定

將菌劑放置在陰涼處保存，兩天后取l0.00 g樣品加入100 mL生理鹽水在200 r/min下振蕩2 h，然后立即用稀釋平板計數(shù)法測定釋放的菌數(shù)。

1.3.3 單載體吸菌后條件優(yōu)化

（1）菌劑制作

在500 mL三角瓶中裝入200 mL培養(yǎng)液，將ZX5、ZZ9、ZH9分別接種到發(fā)酵液體培養(yǎng)基中。

真菌的培養(yǎng)基為改良的高氏一號培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，蛋白胨5.00 g，硝酸鉀1.00 g，氯化鈉0.50 g，磷酸氫二鉀0.50 g，硫酸鎂0.50 g，硫酸亞鐵0.01 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.2～7.4。

細菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.00 g，蛋白胨5.00 g，氯化鈉5.00 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2。

在25 ℃下靜置培養(yǎng)至對數(shù)期。

（2）載體制作稱量三角瓶子重量m1，分別稱量各種載體大約100.00 g于三角瓶中，于0.1 MPa，滅菌20 min后，放于烘箱中在60 ℃下烘干48 h直到衡重，稱重為m2，由此得到載體凈重。按載體的吸水率，分別向載體中加入相應菌液量，放于30 ℃下儲存。分別在其第1、3、5、9、12、15、30天測定其纖維素酶酶活及過氧化氫酶酶活。

（3）酶活測定

a、纖維素酶活性測定（硝基水楊酸比色法）

葡萄糖標準溶液（1.0 mL標準液含0.2～0.8 mg葡萄糖）繪制：分別取不同濃度標準溶液1.0 mL移入25.0 mL容量瓶中，加3.0 mL二硝基水楊酸溶液。將試管放在沸騰水浴上5 min，然后迅速冷卻3 min。定容，15 min后在分光光度計上于波長540 nm處比色測定。以光密度值為縱坐標，以葡萄糖濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

操作步驟：稱1 g菌劑于50.0 mL三角瓶中，加20 mL 1%羧甲基纖維素溶液、5.0 mL pH值為5.5磷酸鹽緩沖液及1.5 mL甲苯，將三角瓶放在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結束后，過濾并定容25.0 mL。取1.0 mL濾液，然后按照繪制標準曲線顯色法比色測定。纖維素酶活，以72 h，10.00 g土壤生成葡萄糖毫克數(shù)表示。

b、過氧化氫酶活性測定

酶液提?。喝?0.0 mL試管4 支，2 支為樣品測試管，2 支為對照，各管分別加入粗酶液0.2 mL。磷酸緩沖液（0.2 M，pH值7.8）1.5 mL，水1.0 mL。對照管加入的酶液為沸水浴中保持2 min的酶液。

活性測定：25 ℃預熱后，逐管加入0.3 mL的H2O2溶液（0.1 M），每加完一管立即計時，并迅速測定其在240 nm下的吸光值，每隔1 min讀數(shù)1 次，共測4 min，待4 支試管全部測完后，計算其過氧化氫酶酶活。

以1 min內A240減少0.1的酶量為1 個酶活單位：過氧化氫酶活性=（△A240·VT）（0.1V1·t·wF）-1

式中：A0為對照管加入煮死酶液吸光值；A1、A2為樣品管吸光值；VT為粗酶液提取液總體積（mL）；V1為測定用粗酶液體積（mL）；wF為樣品鮮重（g）；0.1為A240每下降0.1為1 個酶活單位；t為加過氧化氫到最后一次讀數(shù)時間（min）

2 試驗結果

2.1 單載體的吸水率

載體的吸水率越高，表明對菌的吸附能力越強。從表1可以看出，鋸末、珍珠巖、硅藻土的吸水率比較高，也就說明這3 種載體的吸附能力比較好，對菌的吸附能力較強，吸水率依次是鋸末＞珍珠巖＞硅藻土。其中，吸水率最高的鋸末是吸水率最低的草炭的5.7 倍，也是吸水率第2高的珍珠巖的1.2倍。但載體的選擇還應看隨著時間的增長，其對菌的釋放力，菌劑在載體上的存活時間以及菌劑的活力如何。

表1 單載體的吸水率

2.2 單載體的吸菌量

由圖1可以看出，載體對于ZX5的吸附能力普遍較強，能達到1.0×1010～2.0×1010CFU/g，其中鋸末、珍珠巖以及硅藻土的表現(xiàn)比較優(yōu)秀；ZZ9次之，普遍在1.0×1010g，其中也是鋸末、珍珠巖、硅藻土的表現(xiàn)比較好；而對于ZH9的吸附能力則很弱，只有1.0×109g左右，鋸末、珍珠巖和硅藻土的表現(xiàn)較為突出。這也驗證了吸水率較好的載體對于菌的吸附性也很好。

圖1 單載體的吸菌量

2.3 菌劑固定后的過氧化氫酶變化

過氧化氫酶（Catalase）又叫接觸酶，可以促進堆肥中有機物的氧化分解。過氧化氫是代謝過程中產生的廢物，會對機體造成一定損害，因此，必須迅速將過氧化氫轉化為其他無害或毒性較小的物質。而過氧化氫酶便是用與催化細胞中的過氧化氫分解的工具，幾乎所有的生物機體都存在過氧化氫酶，其酶促活性為機體提供了抗氧化防御機理。本研究通過測定各菌種固定后的過氧化氫酶活性，各菌種固定后隨著儲存時間延長，其酶活性的變化表現(xiàn)不同。據(jù)此將3 種菌固定在7 種載體上的酶活變化：菌種ZH9和ZZ9，二者固定在麥麩及干牛糞上的過氧化氫酶活性變化呈現(xiàn)“山峰”型，即均經(jīng)歷了先升高再降低的過程，并且其酶活性在第2～4 天達到最高峰。

由圖2可以看出，菌ZH9在麥麩及干牛糞上的過氧化氫酶活性較高，尤其是在麥麩上的表現(xiàn)較好。在第4天幾乎所有載體的過氧化氫酶活性均出現(xiàn)峰值，隨后都開始降低，除麥麩外的載體在第5天以后活性都接近0；而在麥麩上的過氧化氫酶活性則逐漸降低，在第7天的時候活性才消失。

圖2 ZH9的過氧化氫酶活性

由圖3可以看出，菌ZZ9在麥麩上的過氧化氫酶活性表現(xiàn)較為突出，其次為干牛糞，但在第4天以后幾乎所有載體上ZZ9的過氧化氫酶活性都幾乎為0，只有干牛糞上的過氧化氫酶活性持續(xù)性較好，穩(wěn)定性也較好。

圖3 ZZ9的過氧化氫酶活性

由圖4可以看出，菌ZX5在載體上的過氧化氫酶活性相對于其他菌劑來說普遍不高。ZX5在干牛糞上的過氧化氫酶活性較其他載體一直偏高，在第3天時出現(xiàn)峰值?？傮w來說，ZX5菌的過氧化氫酶活性普遍較高。

圖4 ZX5的過氧化氫酶活性

2.4 菌劑固定后的纖維素酶變化

纖維素酶（Cellulase）是酶的一種，在分解纖維素的過程中起生物催化作用。細菌、真菌、動物體內等都可以產生纖維素酶。纖維素是地球上分布最廣、含量最豐富的碳水化合物，占全球植物總干重的30%～50%，是植物細胞壁的主要成分[5]。而且纖維素還是牛糞堆肥原料中比較難分解的成分，它可在纖維素酶作用下水解為纖維二糖，進而水解為葡萄糖[6]。本研究纖維素酶活性是以72 h后1 g肥生成的葡萄糖mg數(shù)表示。

由圖5可以看出，菌ZH9在麥麩上的纖維素酶活性比較高，其走勢呈現(xiàn)一種先下降后緩慢上升的過程；在鋸末上的纖維素酶活性次之，但相對來說比較平穩(wěn)。在其他載體上的活性幾乎為0。而在接種初始階段，該菌在麥麩與鋸末上的纖維素酶活性較高；而在接種的最后階段亦是這兩種載體上的纖維素酶活性較高。

圖5 ZH9的纖維素酶活性

由圖6可以看出，菌ZZ9在麥麩上的纖維素酶活性表現(xiàn)較好，其走勢經(jīng)歷一個先下降后緩慢上升的的變化，并在最后達到其高峰。而該菌在其他載體上表現(xiàn)一般，其纖維素酶活性都接近0。

圖6 ZZ9的纖維素酶活性

由圖7可以看出，菌ZX5的纖維素酶活性在麥麩上的表現(xiàn)最為突出，其酶活經(jīng)歷了一個先下降，后上升的過程，并在接種的最后達到了峰值。該菌在鋸末上的表現(xiàn)次之，其纖維素酶活性較之麥麩偏低，但其酶活的變化不是很顯著，比較平穩(wěn)。而其他幾種載體顯然不適合ZX5菌的保存及再繁，其纖維素酶活性幾乎為0。

圖7 ZX5的纖維素酶活性

3 結論

在過氧化氫酶酶活的測定中，麥麩及干牛糞的表現(xiàn)均比較優(yōu)秀且3 種菌都在第6～8天的時候出現(xiàn)峰值。在纖維素酶酶活的測定中，亦是麥麩與干牛糞的表現(xiàn)較為突出，而在后期接到麥麩上的3 種菌的纖維素酶酶活都大幅度提高，可能是到后期載體中的營養(yǎng)物質比較少，微生物便開始分泌纖維素酶消化載體中的纖維素。

綜上所述，從單載體試驗中可以挑出以下4 種適合ZX5、ZZ9、ZH9三種菌吸附的載體：麥麩、硅藻土、干牛糞及鋸末。因此，在復合載體的試驗中，表現(xiàn)比較好的有機載體麥麩可以為微生物提供所需要的營養(yǎng)，而鋸末的吸水性較好且疏松透氣，適合作為載體的支架物質，3 種菌在干牛糞因其蓬松，富含有機質的特點表現(xiàn)相對較好，尤其將干牛糞作為載體可以縮短其接種到牛糞后的適應期，而硅藻土則主要作為無機載體來吸附微生物。