柴寶峰，李曉琪，劉晉仙

（山西大學(xué) 黃土高原研究所，黃土高原生態(tài)恢復(fù)山西省重點實驗室，山西 太原 030006）

0 引言

季節(jié)性凍融是溫帶大陸氣候和溫帶季風(fēng)氣候區(qū)重要的氣候特征。世界上大約有一半的湖泊，尤其是在中高緯度地區(qū)的湖泊都存在季節(jié)性凍融現(xiàn)象［1］。湖冰物候受區(qū)域以及全球氣候變化影響，而高海拔的山地是氣候變化的敏感區(qū)［2］。近年來，由于全球氣溫升高，湖泊覆冰時間減少，導(dǎo)致湖泊的季節(jié)性動態(tài)發(fā)生變化［1］，進而改變湖泊的生態(tài)功能［3］。湖冰在蓄積熱量、控制湖泊水體溫度、維持湖泊生物多樣性等方面發(fā)揮著重要作用。冰層對湖泊的影響包括降低水溫、降低光合有效輻射、改變湖泊水體混合狀態(tài)、減少水體和大氣交換、減少陸源徑流輸入等，并且可以通過改變這些能量和物質(zhì)輸入的時間和空間特征影響湖泊生態(tài)系統(tǒng)。溫度變化直接影響凍融過程的發(fā)生，并使湖泊水動力發(fā)生變化［4］，從而對微生物的分布和多樣性造成影響，進而影響到更高的營養(yǎng)級，最終對整個湖泊生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響［5］。營養(yǎng)物質(zhì)通常是山地湖泊中影響微生物生長的限制因素，在冰雪覆蓋期間發(fā)生的營養(yǎng)狀況的改變可能會篩選出寡營養(yǎng)型微生物類群；光有效輻射的降低會影響光合自養(yǎng)微生物的豐度和活性，從而改變冰期的初級生產(chǎn)力。盡管湖冰物候的改變會導(dǎo)致湖泊生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生一系列變化，但季節(jié)性凍融如何影響山地湖泊生態(tài)系統(tǒng)中細菌群落的多樣性目前尚不清楚。已有的研究也僅通過對比湖冰產(chǎn)生前后的湖泊條件來間接推斷微生物群落的變化［6］，有研究表明湖泊中的微生物在不同季節(jié)間的變化存在級聯(lián)效應(yīng)，如冬季湖泊中藻類的組成和多樣性直接決定春季是否會出現(xiàn)水華［7］，因此進一步深入了解冬季湖泊狀況，對湖泊生態(tài)系統(tǒng)的整體認識具有重要意義。

細菌是湖泊生態(tài)系統(tǒng)中的重要成員，不僅是多種元素循環(huán)的驅(qū)動者，也是水生食物網(wǎng)的主要組分。細菌群落數(shù)量龐大，種類繁多，在微食物網(wǎng)中占據(jù)重要地位。已有研究表明，湖泊深度［8］、營養(yǎng)鹽濃度［9］、降水量［10］、水體溫度［11］等都會影響細菌群落的多樣性及其空間分布。凍融過程對細菌群落影響的研究多集中在土壤［12］、海洋和極地［13］，這些研究結(jié)果表明凍融顯著改變了細菌群落的組成和結(jié)構(gòu)［14］。在許多淡水和沿海系統(tǒng)中，微生物群落的季節(jié)差異與有機物和養(yǎng)分輸入的差異有關(guān)，而在內(nèi)陸淡水山地湖泊中細菌群落在凍融過程中是否和其他生境中的變化具有一致性，目前還未有報道。因此對凍融過程中細菌群落在湖泊生態(tài)系統(tǒng)中適應(yīng)性的全面了解，對于未來更好地管理和維護湖泊生態(tài)系統(tǒng)功能具有深遠的意義。本研究通過分析冰封期和消融期山西寧武公海湖中的細菌群落，旨在探討以下問題：（1）季節(jié)性凍融如何影響細菌群落的組成和多樣性？（2）季節(jié)性凍融如何影響細菌群落中不同物種間的互作關(guān)系？

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

公海湖（38°91′N，112°23′E），位于山西省寧武縣西南的管涔山，海拔1 854 m，面積0.36 km2，最大水深約8 m，湖床平坦，為降水補給的小型封閉淡水湖［15］。該區(qū)域?qū)贉貛Ъ撅L(fēng)氣候，冬季寒冷漫長多風(fēng)雪，夏季涼爽，降水充沛，年平均氣溫6.2℃，年均降水量470 mm～770 mm。公海湖于每年11月初開始結(jié)冰進入冰封期，一直持續(xù)到翌年3月底，在這段時間內(nèi)湖面被冰層完全覆蓋，湖水波動較小，處于較穩(wěn)定的狀態(tài)，隨著天氣轉(zhuǎn)暖，冰層逐漸消融，直至4月底完全融化（圖1）。在冰封期，湖水和外界無直接接觸，處于隔絕狀態(tài)，水體在冰蓋下和大氣之間的物質(zhì)能量交換被阻隔。

圖1 山西省寧武縣公海湖全景圖（A）2019年4月消融期；（B）2018年12月冰封期Fig.1 Gonghai Lake located in Ningwu，Shanxi.（A）Ice free in April 2019；（B）Ice covered in December 2018

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集、理化性質(zhì)測定

實驗所用樣品分別采集于2018年12月和2019年4月。在公海湖中央從表面到湖底每隔2 m設(shè)立一個采樣點，共5個采樣點（分別是0 m、2 m、4 m、6 m、8 m），每個采樣點取3個重復(fù)，每個重復(fù)間隔1 m左右。在每個采樣點利用采水器收集水樣3 L裝于無菌塑料桶中運回實驗室，后用0.2 μm聚碳酸酯濾膜過濾2.5 L，然后把濾膜放置到無菌離心管中，于-20℃保存用于后續(xù)微生物基因組的提取，剩余的0.5 L用于理化性質(zhì)分析。

水體溫度（T）、pH、電導(dǎo)率（EC）、溶解氧（DO）、鹽度（SAL）、氨態(tài)氮（）和硝態(tài)氮（）含量用便攜式水質(zhì)監(jiān)測儀（Aquread AP-2000，UK）原位測定；總碳（TC）、總有機碳（TOC）和無機碳（IC）含量用TOC分析儀（Shimadzu，TOC-VCPH，Japan）測定；亞硝態(tài)氮（）、硫酸鹽（）和磷酸鹽（）含量用全自動間斷化學(xué)分析儀（Cleverchem Anna，DeChem-Tech，Germany）測定。

1.2.2 樣品DNA提取及高通量測序

用快速提取試劑盒（MP Biomedicals，Solon，OH，USA）提取水體樣本基因組，測定濃度和純度后于-20℃保存。細菌PCR擴增使用引物338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG） 和 806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）擴增 V3-V4高變區(qū)，擴增體系及條件參照Liu等人的方法［16］進行。通過Illumina Miseq高通量測序平臺（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）對擴增產(chǎn)物進行測序。獲得序列后，將原始序列在FLASH中進行合并，并使用QIIME去除嵌合體，按照97%的相似性進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，細菌序列使用SILVA庫進行比對，置信閾值為70%。最后對所得OTU按最小樣本序列數(shù)抽平后進行后續(xù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗，符合正態(tài)分布檢驗的數(shù)據(jù)使用配對樣本t檢驗，不符合的使用wilcoxon秩和檢驗。水體理化參數(shù)的季節(jié)間差異使用配對樣本t檢驗進行分析，細菌群落α多樣性指數(shù)的季節(jié)間差異和細菌優(yōu)勢類群的組間差異用wilcoxon秩和檢驗分析；利用Spearman相關(guān)性分析不同季節(jié)優(yōu)勢類群和環(huán)境因子的相關(guān)性（SPSS 20.0）；基于Bray-Curtis距離的PCoA用于分析細菌群落的空間分布格局（R軟件Ape程序包），用ANOSIM分析檢驗群落結(jié)構(gòu)的差異性（R軟件Vegan程序包），在Canoco 5軟件中通過前選擇篩選出對群落結(jié)構(gòu)有顯著影響的環(huán)境因子，然后通過冗余分析（RDA）分析細菌群落和水體理化參數(shù)的關(guān)系。為了揭示細菌群落間的相互作用，在屬水平采用隨機矩陣原理（random matrix theory，RMT）構(gòu)建不同時期微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)［17］。網(wǎng)絡(luò)性質(zhì)參數(shù)及相關(guān)過程均在Molecular Ecological Network Analyses Pipeline（MENA）（http：//ieg4.rccc.ou.edu/mena）網(wǎng)站上完成［18］。為確保在同等條件下進行網(wǎng)絡(luò)分析，采用0.83的閾值來構(gòu)建冰封和消融期的兩個網(wǎng)絡(luò)，最后利用Cytoscape 3.6.1軟件將結(jié)果可視化。所有統(tǒng)計分析的顯著性水平均為95%（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 水體理化因子

水體理化參數(shù)在季節(jié)性凍融過程中發(fā)生了顯著改變。湖面覆冰消融后的4月水體T、DO、、、TC、TOC和IC濃度顯著增高（P＜ 0.05）；而EC和濃度則在12月的冰封期較高（P＜0.05）；濃度在2個時期間沒有顯著的變化（表1）。

表1 公海湖在消融期和冰封期的水體理化參數(shù)Table 1 Physicochemical parameters in ice-free and ice-cov‐ered periods of Gonghai Lake

2.2 細菌群落組成

在冰封期和消融期的細菌群落隸屬于53個門，126個綱，338個目，575個科，1 039個屬，2 066個種，5 090個OTU。相對豐度＞1%的分類群定義為優(yōu)勢類群，相對豐度＜1%的合并為其他（others）。其中6個門為優(yōu)勢門，包括放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍藻門（Cyanobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和Patescibacteria（圖2A）。共有27個優(yōu)勢屬，其中HgcI_clade是豐度最高的屬，其相對豐度在冰封期和消融期分別占12.15%和16.82%（圖2B）。

圖2 消融期和冰封期優(yōu)勢細菌組成。（A）優(yōu)勢細菌門；（B）優(yōu)勢細菌屬Fig.2 Composition of dominant bacterial taxas during ice free and ice covered periods.（A）Phylum level；（B）Genus level.

對優(yōu)勢類群相對豐度的組間差異性分析的結(jié)果顯示，放線菌門的相對豐度在消融期顯著高于冰封期，而擬桿菌門和疣微菌門的相對豐度在冰封期較高，其余3個優(yōu)勢門的相對豐度在季節(jié)性消融過程中均沒有發(fā)生顯著變化（圖3A）。在屬水平上，27個優(yōu)勢屬中有23個優(yōu)勢屬的相對豐度在湖面覆冰消融過程中發(fā)生了顯著變化。Fluviicola、LD29、Candidatus_Aquirestis、norank_o__PeM15、GKS98_freshwater_group、norank_f__NS11-12_marine_group、MWH-UniP1_aquatic_group、定慧桿菌（Dinghuibacter）、Terrimicrobium和噬冷菌屬（Algoriphagus）這10個屬的相對豐度在冰封期顯著高于消融期；其余13個屬的相對豐度則在消融期顯著高于冰封期（圖3B）。優(yōu)勢類群相對豐度在湖冰凍融過程中的變化與水體理化參數(shù)有顯著的相關(guān)性，不論是在門水平還是屬水平不同類群相對豐度的變化主要受T、pH、DO、EC、氮和碳（TC、TOC）等理化因子變化的影響（圖4）。

圖3 消融期和冰封期細菌優(yōu)勢類群相對豐度的變化趨勢（A）門水平；（B）屬水平Fig.3 Changes in relative abundance of dominant bacterial taxas during the ice free and ice covered period（A）Phylum level；（B）Genus level

圖4 水體理化參數(shù)和細菌優(yōu)勢類群相對豐度的相關(guān)性熱圖（A）門水平（B）屬水平Fig.4 Heat map of the correlation between the physical and chemical parameters of the water and the relative abundance of dominant bacterial taxas（A）Phylum level（B）Genus level

2.3 細菌群落的多樣性

細菌群落的α多樣性在季節(jié)性凍融過程中發(fā)生了一定的變化。在消融期細菌群落的OTUs和Simpson指數(shù)顯著高于冰封期（P＜0.05），而Shannon指數(shù)在兩個時期間沒有顯著差異（圖5）。OTU數(shù)目與多種理化因子（除了和）存在顯著的相關(guān)性，Simpson指數(shù)主要與TC和TOC顯著相關(guān)（表2）。

圖5 消融期和冰封期細菌群落的α多樣性Fig.5 Alpha-diversity of bacterial communities during the ice-free and ice-covered periods

表2 細菌群落α多樣性與水體理化參數(shù)的Spearman相關(guān)性分析Table 2 Spearman Correlation analysis of α-diversity of bacterial community and physicochemical parameters in Gonghai Lake

細菌群落β多樣性在冰封期和消融期間變化顯著。基于Bray-Curtis距離的PCoA分析結(jié)果顯示，兩個時期細菌群落明顯分離（ANOSIM，R=0.986，P＜ 0.01），在冰封期不同采樣點的群落更聚集（圖6A）。RDA結(jié)果顯示，細菌群落β多樣性在2個時期的差異主要受水體T、DO、和TOC的顯著影響（F=12.5，P＜ 0.01，圖6B）。

圖6 消融期和冰封期（A）在OTU水平基于Bray-Curtis距離的細菌群落PCoA排序圖；（B）細菌群落與水體理化參數(shù)的RDA分析Fig.6 （A）PCoA ordination of bacterial community distribution pattern based on Bray-Curtis distance at OTU level；（B）RDA analysis of bacterial community and physical and chemical parameters of water in ice-free and ice-covered periods

2.4 不同時期細菌群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)

細菌群落的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖7）在冰封期共有93個節(jié)點，155條邊，平均度為3.333，平均聚集系數(shù)為0.298，平均路徑距離為3.671；在消融期節(jié)點數(shù)、邊數(shù)和模塊數(shù)均高于冰封期，共有188個節(jié)點和677條邊，平均度為7.202，平均聚集系數(shù)為0.277，平均路徑距離為4.049。冰封期正相關(guān)邊數(shù)占82.581%，負相關(guān)邊數(shù)占17.419%；消融期正相關(guān)邊數(shù)占66.027%，負相關(guān)邊數(shù)3占3.973%（表3）。兩個時期不同屬間主要為正相關(guān)關(guān)系，但由冰封期過渡到消融期正相關(guān)邊數(shù)占比有所降低，負相關(guān)邊數(shù)占比提升了將近16%。在冰封期多數(shù)節(jié)點隸屬于變形菌門（37個），其次是擬桿菌門（16個）和放線菌門（14個）；消融期多數(shù)節(jié)點隸屬于變形菌門（77個），其次是擬桿菌門（28個）和放線菌門（23個）（圖7）。

表3 消融期和冰封期細菌群落網(wǎng)絡(luò)圖屬性Table 3 Network properties of bacterial community in ice-free and ice-covered periods

圖7 （A）消融期和（B）冰封期細菌群落共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Co-occurrence network of bacterial community in（A）ice-free period and（B）ice-covered periods

從冰封期到消融期，細菌群落的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)了關(guān)鍵節(jié)點。在消融期共有3個關(guān)鍵節(jié)點分別是norank_f_Rhodocyclaceae、Sphingorhabdus和 氫 噬胞菌屬（Hydrogenophaga），這三個細菌屬均隸屬于變形菌門，其中Sphingorhabdus和氫噬胞菌屬為模塊中心點，norank_f_Rhodocyclaceae為連接節(jié)點（圖8）。

圖8 消融期和冰封期細菌類群拓撲作用Fig.8 Topological roles of bacterial taxas in ice-free and ice-covered periods

3 討論

3.1 季節(jié)性凍融對細菌群落的影響

微生物豐度和組成的變化往往是對氣候變化和養(yǎng)分有效性的響應(yīng)［19］。本研究表明，多數(shù)細菌的相對豐度在湖冰凍融過程中發(fā)生了顯著變化，而這與水體的理化參數(shù)變化顯著相關(guān)。季節(jié)性凍融主要由于溫度變化所致。溫度可以改變微生物的豐度和代謝活性，對細菌群落有選擇作用，同時對微生物的季節(jié)動態(tài)演替也有很好的預(yù)測作用［20］。與多數(shù)研究結(jié)果一致，本研究中放線菌門、變形菌門、擬桿菌門為主要優(yōu)勢細菌門，在淡水中廣泛分布。放線菌門的相對豐度在消融期顯著高于冰封期，而擬桿菌門和疣微菌門的變化趨勢則相反，在冰封期它們的相對豐度明顯升高（圖3）。放線菌多數(shù)是好氧菌，多分布在有機物豐富的地區(qū)，屬于放線菌門的hgcI_clade屬的豐度在消融期顯著高于冰封期，其豐度變化和TOC濃度顯著正相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)hgcI_clade對含碳化合物的利用能力較強［21］，因此有機物豐富且DO充足的消融期更適合放線菌的生長。擬桿菌自身對低溫嚴寒有很好的適應(yīng)性［22］，所以能夠在冰封期更好的生存，這與在土壤中觀察到的現(xiàn)象一致［23］。疣微菌門廣泛分布在各個生境中，在前期的研究中被證明更偏愛生活在寡營養(yǎng)環(huán)境中［24］，它們和呈負相關(guān)關(guān)系（圖4A），在冰封期的相對豐度顯著高于消融期，歸屬于疣微菌門的屬LD29被發(fā)現(xiàn)在冰封期的相對豐度顯著高于消融期（圖3B），冰封期冰蓋減少了外部對水體的物質(zhì)輸送，湖泊中營養(yǎng)物質(zhì)較消融期匱乏（表1），這一時期可能更適合寡營養(yǎng)生活史的疣微菌門。

消融期細菌群落的OTUs和Simpson指數(shù)顯著高于冰封期，Shannon指數(shù)也高于冰封期，但未達顯著水平（圖5）。和已有的研究結(jié)果一致，冰封期細菌生物量通常較低［25］，這可能是由于低溫、營養(yǎng)物質(zhì)再礦化減少和陸地有機物輸入受限等因素所致［26-28］。季節(jié)性凍融導(dǎo)致的細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化主要受T、DO、和TOC的影響（圖6）。許多研究已經(jīng)證實了水溫是影響水體中細菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素［29］，而冰封期和消融期的溫度差異顯著（表1）。水溫對細菌活性有直接影響，也可通過調(diào)節(jié)水體中各種生化反應(yīng)、水體中的動植物等間接影響其結(jié)構(gòu)和組成。冰封期由于冰層阻隔，冰下水體和外界發(fā)生物質(zhì)交換減少，與消融期相比水體中DO、和TOC含量明顯較少。溶解氧是冬季冰下微生物群落多樣性的限制因子［3］，在消融期水體中的溶解氧濃度升高，直接導(dǎo)致需氧細菌類群大量增殖。水體中的和TOC可以通過上行效應(yīng)對細菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生直接影響［30］，同時也可以通過影響原生動物等對細菌有捕食作用的生物而對其造成間接影響［31］。

3.2 季節(jié)性凍融對細菌類群相互作用的影響

為了進一步研究凍融作用對山地湖泊細菌間相互作用的影響，構(gòu)建了細菌群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖。整體拓撲特征表明，網(wǎng)絡(luò)連通性曲線能較好地擬合冪率模型，R2分別為0.773和0.756，表明網(wǎng)絡(luò)中只有少數(shù)節(jié)點有大量連接。消融期節(jié)點數(shù)和邊數(shù)顯著高于冰封期，說明消融期細菌類群間的相互作用更復(fù)雜（表3、圖7）。微生物能對外界環(huán)境變化作出迅速反應(yīng)，網(wǎng)絡(luò)的平均路徑長度越短，外界干擾越容易在更短的時間內(nèi)波及整個網(wǎng)絡(luò)［32-33］。在冰封期共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的平均路徑短于消融期（3），說明在冰封期細菌群落受外部干擾的敏感性增加，而在消融期隨著湖冰的融化，湖泊環(huán)境條件的改善（與外界物質(zhì)交換不受限，溶解氧含量增加等），細菌群落對外部干擾的抵抗能力會增強。已有的研究表明，越復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)往往對外界干擾的抵抗力更強，對信息和資源的傳遞也更加高效［34］。

共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)可以代表生態(tài)系統(tǒng)中各種生物間的相互作用，如捕食、競爭和互惠共生，各種群通過相互作用連接在一起，任意兩個節(jié)點之間的連線代表著微生物間的相互作用或者生態(tài)位共享。正相關(guān)關(guān)系被認為是不同物種間的合作和生態(tài)位重疊，而負相關(guān)關(guān)系是生態(tài)位分離、競爭等的結(jié)果［35］。雖然兩個時期都是以正相關(guān)邊數(shù)居多，但由冰封期過渡到消融期，正相關(guān)邊數(shù)占比有所降低，負相關(guān)邊數(shù)占比提升了將近16%（表3）。這表明雖然各個類群在冰封期和消融期都是以協(xié)同合作為主，但隨著湖面冰層消失，細菌間競爭作用逐漸增強，這可能是由于養(yǎng)分的增多導(dǎo)致了細菌生物量的增加，從而加劇了彼此間的競爭作用［18］。也有研究指出，微生物間往往會形成共同協(xié)作的模式來共同抵御環(huán)境脅迫［36］，這也為上述現(xiàn)象提供了合理的解釋。微生物群落組成的變化往往可以通過微生物網(wǎng)絡(luò)的模塊變化來體現(xiàn)［37］，消融期更多的模塊數(shù)代表了更高的功能多樣性（圖7，表3）。冰封期節(jié)點最多的細菌屬于變形菌門、擬桿菌門和放線菌門，消融期節(jié)點最多的細菌門和冰封期一致，而這些細菌類群在兩個時期均為優(yōu)勢門，這表明在群落中相對豐度較高的物種具有較高的交互潛力。不同的節(jié)點可能在網(wǎng)絡(luò)圖中扮演不同的角色，根據(jù)Z-P圖可以識別微生物網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵物種。從冰封期到消融期，網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點增多。消融期共有3個關(guān)鍵節(jié)點（圖8），由此可知，冰封作用導(dǎo)致了微生物網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵物種的減少，使得細菌類群之間的相互作用發(fā)生了改變。

4 結(jié)論

本研究旨在探究細菌群落的組成和結(jié)構(gòu)在冰封期和無冰期如何變化。凍融期間細菌優(yōu)勢類群的相對豐度受到凍融作用的影響發(fā)生了明顯的改變，冰蓋的形成抑制了一些細菌類群的生長，同時也促進了一些類群的生長，各細菌類群的相對豐度變化趨勢不一。消融期細菌群落的α多樣性顯著高于冰封期，且兩個時期的細菌群落結(jié)構(gòu)也具有顯著差異。季節(jié)性凍融顯著改變了細菌各類群之間的相互作用，冰消融后細菌網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性增加，物種之間的競爭潛力提高，整個群落的抗干擾力增強。