張麗萍 ，裴雁曦*

（1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.特色植物資源研究與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006）

0 引言

近年來隨著H2S相關(guān)研究的日益深入，發(fā)現(xiàn)生理濃度的H2S在生物體中承擔(dān)著調(diào)控多種生理功能的作用，與NO和CO并稱為氣體信號(hào)分子［1］。研究發(fā)現(xiàn)H2S參與植物發(fā)育的多個(gè)過程，如種子萌發(fā)、根的形態(tài)建成、光合作用、氣孔運(yùn)動(dòng)、開花調(diào)控、延緩衰老等［2］。在植物抵抗各種環(huán)境脅迫時(shí)，H2S通過調(diào)控逆境相關(guān)基因表達(dá)、蛋白質(zhì)的合成、以及對(duì)關(guān)鍵酶進(jìn)行巰基化修飾等多種作用方式緩解脅迫造成的氧化應(yīng)激反應(yīng)［3］。在幫助植物抵抗重金屬脅迫時(shí)，H2S可以調(diào)節(jié)植株對(duì)金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，吸收和螯合，降低重金屬離子在體內(nèi)的有效含量，減少重金屬對(duì)植物造成的損傷。H2S在發(fā)揮以上作用時(shí)還需要Ca2+、NO、H2O2、乙烯等信號(hào)分子的參與［4］。

20世紀(jì)80年代，人們已在多種植物中檢測(cè)到H2S的釋放［5-6］，近年來隨著H2S生理功能研究的不斷深入，植物中H2S的來源也逐漸清晰：通過葉片吸收大氣中的H2S；在亞硫酸鹽還原酶的作用下，將SO32-直接還原成H2S；通過半胱氨酸脫巰基酶（CDes）催化Cys降解生成H2S、丙酮酸鹽和NH3。最后一條途徑是植物體內(nèi)H2S的主要來源，CDes被認(rèn)為是植物體內(nèi)產(chǎn)生H2S的最重要的酶。根據(jù)催化底物Cys的不同構(gòu)型，CDes被分為L-型CDes和D-型CDes，由于植物中富含LCys，所以對(duì)L-型CDes的研究更為深入。DES1（L-Cys desulfhydrases，At5G28030），是第一個(gè)被確定的L-型CDes，它是一種O-乙?；?L-絲氨酸（硫醇）裂解酶，áLVAREZ等［7］證明其具有降解L-Cys生成H2S的功能，且催化活性需要5-磷酸吡哆醛作為助因子。NFS2（Nitrogen fixation S2，At1g08490）定位于質(zhì)體，能夠催化Cys降解產(chǎn)生單質(zhì)硫和丙氨酸，也能催化含硒的Cys降解產(chǎn)生元素硒和丙氨酸［8］。LCD（L-Cysteine desulfhydrases，At3G62130）位于細(xì)胞核內(nèi)，其功能是催化L-Cys 降解生成H2S、NH3和丙酮酸［9］。

當(dāng)植物遭受重金屬脅迫時(shí)，體內(nèi)H2S的含量會(huì)升高。不同濃度的Cd處理后白菜（Brassicapekinensis）幼苗LCD基因表達(dá)量顯著上調(diào)，內(nèi)源H2S含量也隨之增加，說明Cd脅迫能夠激活白菜幼苗內(nèi)源 H2S 的產(chǎn)生［10］；方慧慧等［11］發(fā)現(xiàn)，鉻脅迫通過上調(diào)LCD、DCD和DES1的基因表達(dá)，增加谷子體內(nèi)的H2S產(chǎn)生速率。而且過表達(dá)擬南芥LCD可以增強(qiáng)擬南芥（Arabidopsisthaliana）對(duì)Cd的耐受［12］。以上結(jié)果表明LCD在植物應(yīng)對(duì)重金屬脅迫過程中是調(diào)節(jié)H2S生成的關(guān)鍵酶。

為了詳細(xì)了解Cd這種脅迫信號(hào)是如何影響植物內(nèi)源H2S產(chǎn)生酶LCD，提高內(nèi)源H2S生成的，前期構(gòu)建原核表達(dá)載體，獲得了具有生成H2S能力的重組LCD蛋白，制成了LCD單克隆抗體，希望從體內(nèi)、體外、分子水平、翻譯后水平研究Cd對(duì)LCD的影響。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

擬南芥種子，4℃春化2 d～3 d，播種于育苗缽中（蛭石：營養(yǎng)土=1∶2），培養(yǎng)間光照強(qiáng)度200 μmol·m2·s-1，16 h/8 h（晝/夜），23 ℃，相對(duì)濕度50%～60%。

1.2 實(shí)驗(yàn)處理

生長4周～5周的擬南芥幼苗用1、2.5、5 mmol·L-1CdCl2溶液處理，每育苗缽10 mL，對(duì)照組加等量蒸餾水，處理12、24、48 h后取擬南芥蓮座葉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每一處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3 H2S含量的測(cè)定

稱取約0.08 g擬南芥蓮座葉，放入研缽中，加入0.8 mL 0.05 mmol·L-1的磷酸緩沖液（包含0.2 mmol·L-1抗壞血酸和 0.1 mmol·L-1乙二胺四乙酸（EDTA），pH=7.0），研磨成勻漿，把勻漿轉(zhuǎn)入離心管，用四通道自由基測(cè)定儀檢測(cè)電位變化，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出H2S含量。

1.4 LCD活性的測(cè)定

以每毫克蛋白釋放H2S的速率來衡量LCD活性。擬南芥中LCD的活性測(cè)定方法見文獻(xiàn)［11］。

重組蛋白LCD活性測(cè)定前，在100 μL蛋白中分別加入2、5、10 μL的50 mmol·L-1CdCl2溶液，使蛋白中的 CdCl2終濃度為 1、2.5、5 mmol·L-1，室溫孵育30 min后測(cè)定重組蛋白活性，詳細(xì)步驟見文獻(xiàn)［11］。

1.5 LCD基因的檢測(cè)

液氮研磨擬南芥葉片，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。熒光定量PCR測(cè)定Ct值，計(jì)算2-△Ct表征樣品間基因水平的相對(duì)差異。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western）檢測(cè)蛋白水平的L-Cys脫巰基酶的表達(dá)量

剪取0.3 g擬南芥葉片液氮充分研磨，干粉轉(zhuǎn)入離心管，加 200 μL 蛋白提取液（0.05 mmol·L-1PBS緩沖液，含0.2 mmol·L-1抗壞血酸和0.1 mmol·L-1EDTA，pH=7.0），冰上靜提 3 h；12 000 r/min冷凍離心10 min后取上清，加入1/5上清體積的上樣緩沖液，煮沸5 min，-80℃凍存。12%SDS聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，100 mA轉(zhuǎn)膜10 h。免疫反應(yīng)后用5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽-四唑硝基藍(lán)堿性磷酸酶（BCIP-NBT）顯色。

1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)依據(jù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（M±SD）。SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析處理組間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd處理對(duì)擬南芥H2S含量的影響

用不同濃度CdCl2溶液處理擬南芥4～5周齡幼苗，分別處理在12、24、48 h后測(cè)定H2S含量。從圖1可以看出，Cd脅迫12、24 h時(shí)，擬南芥幼苗中的內(nèi)源H2S含量發(fā)生了顯著（P＜0.05）變化。Cd處理12 h 時(shí)，2.5、5 mmol·L-1CdCl2溶液處理組的內(nèi)源H2S含量顯著升高；處理24 h時(shí)，各濃度Cd處理組中H2S含量均顯著高于對(duì)照組；處理時(shí)間達(dá)到48 h時(shí)，各處理組的H2S含量卻沒有顯著的差異。

圖1 Cd脅迫對(duì)擬南芥H2S含量的影響不同字母表示同一處理時(shí)間不同處理組間差異顯著（P＜0.05）Fig.1 Effects of Cd stress on H2S content on Arabidopsis thaliana.Different letters indicate significant at 0.05 level between different treatment at the same time

2.2 Cd處理對(duì)擬南芥LCD表達(dá)的影響

在Cd脅迫狀態(tài)下，體內(nèi)的H2S在一定時(shí)間內(nèi)會(huì)增加以應(yīng)對(duì)脅迫，為進(jìn)一步研究Cd脅迫如何導(dǎo)致擬南芥體內(nèi)H2S的增加，首先檢測(cè)了擬南芥LCD（AtLCD）的表達(dá)情況（圖2）。Cd處理12 h時(shí)，Cd處理組AtLCD的表達(dá)量均有升高，且5 mmol·L-1Cd處理組的表達(dá)量為對(duì)照組的2.57倍；處理24 h時(shí)，Cd處理組AtLCD的表達(dá)量急劇升高，分別是對(duì)照組的9.79、12.95、18.9倍；處理48 h 時(shí)，Cd處理組AtLCD的表達(dá)量卻與對(duì)照組比下調(diào)顯著。

圖2 Cd處理對(duì)擬南芥LCD表達(dá)的影響Fig.2 Effects of Cd stress on AtLCD expression on Arabidopsis thaliana

2.3 Cd處理對(duì)擬南芥重組LCD蛋白活性的影響

體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Cd脅迫下LCD活性是否升高。利用大腸桿菌原核表達(dá)重組擬南芥LCD蛋白，純化獲得的蛋白用 1、2.5、5 mmol·L-1Cd 處理 30 min后，測(cè)定其酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：重組LCD蛋白受到與擬南芥植株相同濃度的Cd處理時(shí)，處理30 min，僅2.5 mmol·L-1Cd處理組LCD蛋白的活性卻顯著增加了。其他Cd處理組LCD蛋白的活性雖然增加，但與對(duì)照組比差異不顯著（圖3）。

圖3 Cd脅迫對(duì)擬南芥重組LCD蛋白活性的影響*表示處理組與對(duì)照組比差異顯著（P＜0.05）Fig.3 Effects of Cd stress on the activity of recombinant LCD protein in Arabidopsis thaliana*indicate significant at 0.05 level between different treatment

2.4 Cd處理對(duì)擬南芥體內(nèi)LCD活性的影響

體外短時(shí)間Cd處理可以提高LCD重組蛋白的活性。測(cè)定Cd處理后擬南芥植株中LCD的酶活，圖4顯示了Cd脅迫過程中擬南芥幼苗LCD活性的變化。Cd處理12 h時(shí)，葉片中LCD的活性提高，2.5、5 mmol·L-1Cd處理對(duì)LCD活性的提高更為顯著；處理24 h時(shí)，Cd處理組LCD的活性顯著升高，且均高于12 h處理組；Cd處理48 h時(shí)，各處理組擬南芥幼苗中LCD的活性急劇降低，且各處理組間差異不顯著。

圖4 Cd脅迫對(duì)擬南芥LCD活性的影響不同字母表示同一處理時(shí)間不同處理組間差異顯著（P＜0.05）Fig.4 Effects Cd stress on LCD activity in Arabidopsis thaliana.Different letters indicate significant at 0.05 level between different treatment at the same time

2.5 Cd處理對(duì)擬南芥LCD蛋白含量的影響

為了驗(yàn)證Cd處理后LCD的轉(zhuǎn)錄水平升高是否可以導(dǎo)致LCD基因翻譯水平的增加，從而使體內(nèi)LCD活性增強(qiáng)，在Cd處理擬南芥幼苗24、48 h時(shí)提取總蛋白，用LCD抗體進(jìn)行WesternBlot檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理24 h時(shí)，LCD蛋白量隨Cd處理濃度的增加而略有增加（圖5A），但用Image J做Westren-Blot條帶的灰度分析后發(fā)現(xiàn)處理組之間沒有顯著差異；當(dāng)Cd處理時(shí)間達(dá)到48 h時(shí)，各處理組的LCD蛋白含量沒有變化（圖5B）。而且處理24 h時(shí)的各處理組LCD蛋白量均高于處理48 h各組。

圖5 Cd脅迫后擬南芥LCD的Westren檢測(cè)A：Westren檢測(cè)結(jié)果B：Image G分灰度析結(jié)果Fig.5 Western blot analysis of LCD in Arabidopsis thaliana under Cd stress A：Western blot analysis B：Image G analysis

3 討論

LCD作為植物體內(nèi)的L型CDs，催化L-Cys的分解產(chǎn)生H2S，和DES一樣依賴5-磷酸吡哆醛作為輔因子。大量研究表明［13-16］H2S參與了植物應(yīng)對(duì)Cd脅迫的過程，且脅迫發(fā)生時(shí)LCD基因的表達(dá)上調(diào)明顯。本研究結(jié)果表明，Cd脅迫早期，擬南芥體內(nèi)的H2S會(huì)增加；但隨著處理時(shí)間延長到48 h時(shí)，體內(nèi)H2S的含量甚至?xí)@著降低。這可能是由于長時(shí)間較高濃度的Cd脅迫對(duì)植物造成了不可逆的毒害作用，從而使體內(nèi)的新陳代謝減弱，H2S的合成被抑制。擬南芥體內(nèi)LCD編碼基因的表達(dá)量在Cd處理24 h時(shí)顯著升高，但在48 h時(shí)卻恢復(fù)到對(duì)照水平，且各處理組差異不顯著，說明擬南芥LCD的轉(zhuǎn)錄水平增加來響應(yīng)Cd脅迫有時(shí)間效應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn)Cd脅迫發(fā)生時(shí)，擬南芥主要依靠LCD催化L-半胱氨酸促反應(yīng)途徑產(chǎn)生H2S，因?yàn)楫?dāng)LCD活性升高時(shí)，H2S的含量也隨之增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示擬南芥LCD基因的轉(zhuǎn)錄被激活后，LCD活性的顯著升高，體內(nèi)的H2S含量也顯著增加。LCD蛋白Western檢測(cè)結(jié)果顯示LCD蛋白的翻譯水平也略有增加；24 h時(shí)Cd處理組與對(duì)照相比LCD蛋白量略有增加，但變化不顯著，可能是LCD蛋白抗體的特異性不高導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不夠靈敏。

Cd脅迫下，擬南芥幼苗中LCD的轉(zhuǎn)錄水平升高幅度明顯高于蛋白水平的升高幅度，例如處理24 h時(shí)，5 mmol/L Cd處理組的轉(zhuǎn)錄是對(duì)照組的18.9倍，但是相同處理?xiàng)l件下的LCD蛋白水平略有增加，且這時(shí)檢測(cè)到的LCD活性是對(duì)照組的1.7倍。推測(cè)此時(shí)蛋白水平增幅較小的原因除抗體的因素外，可能在LCD蛋白翻譯后存在某種修飾作用，雖然LCD蛋白量沒有顯著提高，但通過修飾作用使蛋白的活性增強(qiáng)。

綜上所述，Cd脅迫造成的擬南芥體內(nèi)H2S的增加主要是通過LCD這條酶促途徑，且較低濃度Cd脅迫后引起LCD的基因表達(dá)和酶活性升高，從而增加體內(nèi)H2S的合成，發(fā)揮其信號(hào)作用來增強(qiáng)植物抵抗Cd脅迫的能力。但是Cd是如何上調(diào)LCD基因表達(dá)，以及Cd脅迫時(shí)是否誘導(dǎo)LCD的翻譯后修飾作用增強(qiáng)，中間的過程和許多組分還需要進(jìn)一步研究。