關(guān)思靜， 王楠， 徐蓉蓉， 葛甜甜， 高靜*，顏永剛， 張崗， 陳瑩， 張明英

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開發(fā)工程技術(shù)研究中心，西安712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083)

原核生物中廣泛存在一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，即雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)，該系統(tǒng)最關(guān)鍵的過程是His-ASP在HK(his-kinase)和RR(response regulator)之間的磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)[1]。Makino等[2]在編譯擬南芥所有RR時發(fā)現(xiàn)了一組基因，每一個都是編碼ARR(authentic response regulator)類蛋白質(zhì)，但是這些基因卻不具有真正的RR所具有的接受磷的Asp殘基，而是被Glu取代，因此將它們命名為偽答調(diào)控(pseudo response regulator，PRR)蛋白，每個PRR都包含一個N端REC的偽響應(yīng)調(diào)節(jié)受體域(pseudo-receiver domain)以及C端植物特有的CCT結(jié)構(gòu)域[3]。基于結(jié)構(gòu)特征，在陸生植物中PRR有3個分支，包括TOC1(PRR1)、PRR7/3和PRR5/9[4]。這5個PRR基因在擬南芥生物鐘系統(tǒng)中扮演著重要的角色，Matsushika等[5]研究證實，它們以PRR9→PRR7→PRR5→PRR3→PRR1的順序被轉(zhuǎn)錄翻譯。目前，PRR家族成員的分子功能尚不清楚，但其生物作用已被明確與晝夜節(jié)律相關(guān)。

晝夜節(jié)律是生活在世界上許多生物體的“時鐘或振蕩器”產(chǎn)生的，這種生物節(jié)律維持一個接近24 h的周期，與地球繞著地軸自轉(zhuǎn)的周期相對應(yīng)，同時受到植物體內(nèi)生物鐘的控制，作為一種計時機制，存在于多種生物體中，控制著生物體遺傳、代謝和生理過程的時間[6]，包括光合作用[7-8]、營養(yǎng)生長階段的生長速度[9]、開花時間、非生物和生物脅迫反應(yīng)，最具有特色的晝夜節(jié)律事件之一是花期的光周期調(diào)控[10]。目前，模式植物擬南芥生物鐘分子機制已經(jīng)得到了廣泛的研究，其基本結(jié)構(gòu)包含2個MYB相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子LHY(late elongated hypocoty)和CCA1(circadian clock-associated 1)以及中心振蕩器的另一個重要組成部分，屬于PRR蛋白的TOC1(timing of Cab expression)[11-12]。其中CCA1和LHY在早上表達，并抑制晚間表達的TOC1，而TOC1又抑制CCA1和LHY的轉(zhuǎn)錄[13-14]。除此之外，PRR家族其他成員(PRR9/7)與CCA1和LHY的啟動子結(jié)合并抑制其表達；而CCA1和LHY又通過結(jié)合啟動子直接促進PRR7和PRR9的表達[15-16]。

PRRs 在模式植物擬南芥中的研究已經(jīng)相當清晰，在其他植物中PRRs的研究較少，多集中于農(nóng)作物，如水稻中鑒定了5個與擬南芥同源的PRR基因，即OsPRR1、OsPRR37、OsPRR73、OsPRR59、OsPRR95[17]；小麥TaPRR37編碼PRR家族蛋白，與擬南芥APRR7和水稻OsPRR37同源[18]；大麥HvPRR37編碼PRR家族蛋白，與擬南芥APRR7同源[19]。甘草是常見的大宗藥材，多生長在西北干旱環(huán)境下，在甘草蛋白分子研究中，已有的工作主要集中在對活性成分合成相關(guān)基因的克隆和表達分析[20-21]，而對PRR蛋白在甘草中的研究卻未見報道。為了揭示PRRs在不同脅迫下的潛在作用，本研究對甘草PRR基因家族(GuPRRgene family)進行了系統(tǒng)分析，并在全基因組水平上分析了PRR基因在干旱、鹽和低磷非生物脅迫下的表達模式，闡明不同脅迫條件下PRRs基因的功能，為進一步了解植物PRRs基因的進化關(guān)系提供了信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用烏拉爾甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)種子購自峰華農(nóng)業(yè)有限公司，種子經(jīng)消毒后，于人工氣候箱(光/暗周期為12 h/12 h)中催芽1周，挑選長勢一致的幼苗采用霍格蘭營養(yǎng)液水培。選擇生長1月的幼苗，分別采用15%聚乙二醇(PEG-6000)進行干旱脅迫處理、150 mmol·L-1氯化鈉(NaCl)進行高鹽脅處理、10 μmol·L-1磷酸二氫鉀進行低磷(LowP)脅迫處理。對照(CK)僅用營養(yǎng)液培養(yǎng)，不做任何處理。3個生物學(xué)重復(fù)，在脅迫處理1周后采集對照和處理組的甘草幼苗地上部分和地下部分，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1轉(zhuǎn)錄組測序 委托杭州景杰生物科技有限公司利用Illumina HiSeq 2000測序平臺對采集甘草樣本進行高通量測序分析。將測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識別轉(zhuǎn)化為raw Data。使用Trimmomatic軟件設(shè)置默認參數(shù)，去除Illumina平臺的FASTQ序列中的接頭，并根據(jù)堿基質(zhì)量值對FASTQ進行修剪，得到clean reads，然后用TopHat2進行參考基因組比對分析。使用RPKM法對reads count進行均一化處理，評估基因的表達量。

1.2.2甘草中偽應(yīng)答調(diào)控蛋白(PRR)的篩選與鑒定 甘草基因組數(shù)據(jù)來自Mochida等[22]已發(fā)表數(shù)據(jù)(http://ngs-data-archive.psc.riken.jp/Gur-genome/)；以擬南芥PRR家族成員APRR1、APRR3、APRR5、APRR7、APRR9基因序列作為查詢序列，運行TBtools工具的本地檢索程序[23]，篩選閾值設(shè)為1×10-5，初步獲得候選甘草PRR基因家族成員；將候選基因的蛋白序列提交到NCBI，進行在線blastp比對，根據(jù)注釋信息篩選出甘草PRR家族相關(guān)的基因；然后將二次比對得到的序列通過NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫和pfam數(shù)據(jù)庫(https://pfam.xfam.org/)進行進一步的結(jié)構(gòu)域驗證，去掉結(jié)構(gòu)域不完整的蛋白序列，最終鑒定出甘草PRR家族成員。

1.2.3甘草PRR家族基因的生物信息學(xué)分析 運行TBtools軟件的Batch SMART程序，對甘草PRR蛋白保守結(jié)構(gòu)域可視化；采用ExPASY-Prot Param(https://web.expasy.org/protparam/)分析篩選出的甘草PRR基因編碼蛋白的理化性質(zhì)；借助Cell-PLoc2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)進行蛋白亞細胞定位預(yù)測；用SOMPA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)；同時采用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)進行甘草PRR蛋白三維建模分析并用PROCHECK(https://servicesn.mbi.ucla.edu/PROCHECK/)對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)檢驗；利用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)在線工具對甘草PRR蛋白進行保守基序分析；提取甘草PRR基因上游2 kb的序列信息，使用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測順式作用元件；通過獲得的甘草基因序列和CDS序列，利用GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析甘草PRR基因結(jié)構(gòu)；采用MEGA7.0軟件進行氨基酸比對和構(gòu)建進化樹，并用GeneDoc軟件編輯比對后的序列。

1.2.4甘草PRR基因家族表達模式分析 利用轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析甘草PRR基因(GuPRR)的表達特征。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)包含甘草干旱、高鹽以及低磷脅迫處理和對照的基因表達數(shù)據(jù)，以不同實驗條件下的RPKM值為表達水平，通過對數(shù)據(jù)進行對數(shù)值轉(zhuǎn)換，利用TBtools的HeatMap程序做熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草PRR基因家族的鑒定

利用TBtools和blastp兩種比對方法，從甘草基因組中鑒定出13條PRR候選蛋白序列。之后通過NCBI-CDD和pfam數(shù)據(jù)庫對13條候選蛋白序列進行保守結(jié)構(gòu)域驗證，發(fā)現(xiàn)其中7條具有完整的REC、CCT結(jié)構(gòu)域(圖1)，其余6條由于結(jié)構(gòu)域不完整而去除。分析這7個甘草PRR基因編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和亞細胞定位(表1)發(fā)現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)的氨基酸大小介于553～837 aa之間；分子質(zhì)量在61.930～91.683 kD之間；等電點最低為5.75(GuPRR2)，最高為8.45(GuPRR4)，其中等電點大于7的有4條，小于7的有3條；氨基酸不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，表明這7條甘草PRR蛋白均為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；總平均親水性均為負值，推測這7條甘草PRR蛋白均為親水蛋白質(zhì)。亞細胞定位結(jié)果顯示，這7條甘草PRR蛋白均存在于細胞核中，與Fuijiwara等[24]的研究結(jié)果吻合，進一步驗證了這7個預(yù)測基因?qū)儆赑RR基因家族。

表1 GuPRR基因家族理化特性

圖1 甘草PRR蛋白保守結(jié)構(gòu)域

2.2 甘草PRR蛋白二級及高級結(jié)構(gòu)

由SOMPA預(yù)測甘草PRR蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn)，甘草PRR蛋白二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈以及無規(guī)則卷曲4種成分組成，其中α-螺旋與無規(guī)則卷曲為主要組成成分，β-轉(zhuǎn)角所占比例最小。隨后利用SWISS-MODEL預(yù)測甘草PRR蛋白三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖2所示，這7個PRR蛋白三級結(jié)構(gòu)可分為4種類型，GuPRR1含有的α-螺旋結(jié)構(gòu)數(shù)量最少，卻含有最多的延伸鏈；GuPRR2和GuPRR3具有相似度較高的三維結(jié)構(gòu)，α-螺旋占比高于其他GuPRR蛋白；GuPRR4和GuPRR5三級結(jié)構(gòu)相似度較高，GuPRR6和GuPRR7三級結(jié)構(gòu)相似度較高。為了檢驗蛋白三級構(gòu)象的合理性，采用了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)檢驗工具PROCHECK對甘草的PRR蛋白三級結(jié)構(gòu)進行檢驗，發(fā)現(xiàn)7個甘草PPR蛋白氨基酸殘基位于最佳區(qū)和次允許區(qū)域的比例分別為98.2%、98.2%、97.8%、97.6%、96.6%、99.4%、99.4%，均超過96%，且G-factors值都大于-0.5，說明這7個PRR蛋白的三維結(jié)構(gòu)是合理的。

表2 甘草PRR蛋白二級結(jié)構(gòu)

圖2 甘草PRR蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3 甘草PRR基因的順式作用元件

提取甘草PRR基因上游2 kb的序列，分析其順式作用元件，結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)，GuPRR基因上游存在4類順式作用元件：①光響應(yīng)相關(guān)元件，如GT1-motif元件、G-box元件、Box4元件、GA-motif元件等；②植物激素響應(yīng)相關(guān)元件，如響應(yīng)SA代謝的TCA-element元件、響應(yīng)ABA代謝的ABRE 元件、響應(yīng)MeJA代謝的CGTCA-motif元件等；③植物生長發(fā)育響應(yīng)相關(guān)元件，如分生組織表達相關(guān)的CTA-box、晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)中的circadian元件等；④逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)元件，如干旱脅迫響應(yīng)元件MBS、低溫脅迫響應(yīng)元件LTR等。進一步研究發(fā)現(xiàn)，7條GuPRR基因中都有光響應(yīng)元件，共111個，占預(yù)測順式作用元件42.7%，表明甘草PRR基因家族可能在光響應(yīng)調(diào)節(jié)中扮演著重要角色。

圖3 GuPRR基因順式作用元件

2.4 甘草PRR蛋白系統(tǒng)進化關(guān)系

為了了解甘草PRR基因家族成員的進化關(guān)系，利用雙子葉植物甘草、擬南芥、大豆、豌豆，以及單子葉植物水稻、小麥、高梁PRR基因家族的全蛋白序列構(gòu)建進化樹。結(jié)果(圖4)顯示，這幾個物種的PRR蛋白被分為4個分支(圖4)，甘草的PRR蛋白分成3組。進一步分析發(fā)現(xiàn)，GuPRR1與APRR1相近，GuPRR2與GuPRR3與APRR5/9更加相近，而GuPRR4～7則歸屬于APRR3/7一組，其中GuPRR4和GuPRR5與APRR3更為相近，GuPRR6和GuPRR7與APRR7更為接近。通過對系統(tǒng)進化樹分支分析發(fā)現(xiàn)，甘草與大豆、豌豆的進化距離較其他物種更短，說明甘草的PRR基因與同科的大豆、豌豆進化關(guān)系更為接近。

注：Gu—甘草；Ps—豌豆；Ga—大豆；A—擬南芥；Os—水稻；Ta—小麥；Sb—高粱。

2.5 甘草PRR家族基因結(jié)構(gòu)

利用MEME在線工具預(yù)測甘草PRR蛋白的保守基序，共預(yù)測到22個motif，結(jié)果如圖5所示，motif 1和motif 3作為REC結(jié)構(gòu)域的保守基序、motif 2和motif 4作為CCT結(jié)構(gòu)域的保守基序，這4個motif出現(xiàn)在所有甘草PRR蛋白中。此外，GuPRR2和GuPRR3、GuPRR4和GuPRR5、GuPRR6和GuPRR7具有相同的motif。為了進一步了解PRR基因的進化關(guān)系，對每個基因的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果(圖6)顯示，GuPRR基因的外顯子數(shù)量8～12不等，內(nèi)含子數(shù)量5～11不等。PRR家族基因成員的系統(tǒng)進化樹分析表明，位于同一分支的GuPRR基因具有相似的內(nèi)含子/外顯子分布，如GuPRR4和GuPRR5基因都具有11個內(nèi)含子和12個外顯子；不同于GuPRR4和GuPRR5所在的分支，另一分支的GuPRR2和GuPRR3具有8個內(nèi)含子和10個外顯子，這表明不同的甘草PRR基因在進化過程中其結(jié)構(gòu)與功能已經(jīng)發(fā)生了分化。保守基序分析表明，預(yù)測的GuPRRs偽受體區(qū)域氨基酸序列與APRRs的氨基酸序列高度一致(圖7A)，且它們的中心含有獨特的谷氨酸殘基(E)；CCT結(jié)構(gòu)域序列的預(yù)測氨基酸序列也與APRRs序列一致(圖7B)，且REC結(jié)構(gòu)域與CCT結(jié)構(gòu)域中間的氨基酸序列具有很大的差異性。

圖5 GuPRR基因家族保守基序

圖6 GuPRR基因結(jié)構(gòu)

A:偽響應(yīng)調(diào)節(jié)受體域；B：CCT結(jié)構(gòu)域

2.6 表達模式

圖8 A所示，甘草地上部分的PRR基因在對照(CK)處理下，GuPRR1/4/5的表達量高于GuPRR2/3/6/7；鹽脅迫(NaCl)處理中，僅GuPRR1上調(diào)表達，其余GuPRRs表達量下調(diào)或未檢測到表達量；干旱脅迫(PEG)處理下，GuPRR1/2/3的表達量上調(diào)，GuPRR6/7/4/5表達量很低或表達量下調(diào)；低磷脅迫(LowP)處理下，僅GuPRR1表達量明顯下調(diào)，其余GuPRR均上調(diào)表達。甘草根PRR基因在各處理中表達模式如8B所示，對照(CK)中，7條GuPRRs均具有較高的表達量；鹽脅迫(NaCl)處理中，僅GuPRR2上調(diào)表達；干旱脅迫(PEG)與低磷脅迫(LowP)處理下，7條GuPRR基因表達量下調(diào)明顯，均低于對照(CK)處理。

A:甘草地上部分；B:甘草根

3 討論

PRRs在植物中普遍存在，并已被證明在調(diào)節(jié)植物晝夜節(jié)律中發(fā)揮作用[1,3,25]。PRRs包含有2個特殊的保守結(jié)構(gòu)域，分別是N端的REC和C端的CCT，這2個保守結(jié)構(gòu)域被一長段不保守的可變域分隔開。研究表明，PRRs的偽響應(yīng)調(diào)節(jié)受體域來自能夠磷酸化的接收域[4]，這個接收域中包含1個保守的天冬氨酸-天冬氨酸-賴氨酸(DDK)基序，而在被子植物的PRRs中，第2個天冬氨酸(D)已經(jīng)轉(zhuǎn)化為谷氨酸(E)[1]。本研究利用生物信息學(xué)從甘草基因組中鑒定得到7個甘草PRR基因，GuPRR1、GuPRR2、GuPRR3、GuPRR4、GuPRR5、GuPRR6、GuPRR7與擬南芥和水稻的PRR基因高度同源。7個基因編碼的蛋白都具有完整的REC和CCT保守結(jié)構(gòu)域，預(yù)測的GuPRRs與APRRs的偽響應(yīng)調(diào)節(jié)受體區(qū)域氨基酸序列一致，且在中心包含一個獨特的E。進化分析將這7個甘草PRR蛋白聚為3類，與擬南芥和水稻的PRR蛋白進化一致。這些結(jié)果說明7個PRR基因?qū)儆诟什輦雾憫?yīng)調(diào)節(jié)基因。

大部分干旱應(yīng)答基因都表現(xiàn)出節(jié)律性表達模式，干旱引發(fā)的生理反應(yīng)也受晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)的影響[26-27]。Marcolino-Gomes等[28]采用RNA-seq和定量分析發(fā)現(xiàn)干旱脅迫引起大豆晝夜節(jié)律基因表達的顯著變化，其中僅有PRR3在中度干旱脅迫處理下上調(diào)表達，而PRR3/7/9均表達減弱。干旱脅迫導(dǎo)致水稻大部分早晨生物鐘基因表達振幅減弱，傍晚和夜晚生物鐘基因表達增強[29]。另外，鹽脅迫也會反饋調(diào)節(jié)生理時鐘的振幅和周期[11]，Habte等[30]研究表明，鹽脅迫改變了大麥根部的時鐘基因表達，使大麥對逆境脅迫的響應(yīng)更為靈敏。本研究結(jié)果中，由對照處理可以看出，PRR基因在甘草根中的表達量高于地上組織，但在脅迫處理中，根中的GuPRR基因僅GuPRR2在鹽脅迫處理中上調(diào)表達；而地上組織中，在不同脅迫處理下均有上調(diào)表達的GuPRR基因，如鹽脅迫處理中的GuPRR1、干旱脅迫處理中的GuPRR2/3、低磷脅迫處理下的GuPRR4等基因，這表明，不同部位甘草PRR基因在脅迫響應(yīng)中存在明顯差異，推測地上組織中的PRR基因在脅迫響應(yīng)中具有更明顯的正向調(diào)控作用。

生物鐘基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能通過這些基因啟動子區(qū)域中存在的順式作用元件發(fā)生，因此，本研究分析了PRRs啟動子區(qū)域，并預(yù)測到了晝夜節(jié)律和光響應(yīng)元件，包括circadian(CAAAGATATC)、G-box(ACACGTGT)等，這些結(jié)果暗示了甘草PRRs可能參與晝夜節(jié)律調(diào)控。除此之外，在啟動子序列中還預(yù)測到干旱響應(yīng)性元件(MBS)、低溫響應(yīng)性元件、無氧誘導(dǎo)相關(guān)元件以及與脫落酸、水楊酸、茉莉酸甲酯、生長素等激素相關(guān)的順式反應(yīng)元件。植物體內(nèi)激素的合成也受晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)。生物鐘調(diào)節(jié)組分CHE(CCA1 hiking expedition)已被證明可以與水楊酸生物合成的主要基因ICS1(isochorismate synthase 1)的啟動子元件結(jié)合，并調(diào)節(jié)水楊酸表達[31]。Li等[32]研究表明，水楊酸可顯著提高烏拉爾甘草不定根中甘草酸、甘草次酸以及多糖等有效成分的含量。Liu等[33]通過 ChIP-seq 技術(shù)發(fā)現(xiàn)PRR7的靶基因在其上游區(qū)域包含脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)，并調(diào)控脫落酸的表達量。研究表明，干旱脅迫下甘草根脫落酸含量顯著增高，且與甘草酸的含量呈顯著正相關(guān)[34]。乙烯和生長素的生物合成也被認為受到晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)[35-36]，二者能夠促進植物根的形成，進而提高植物的生物量以及抗脅迫能力。因此，可以推測甘草PRR基因可能通過調(diào)控水楊酸、脫落酸等激素水平影響其生長發(fā)育和次生代謝產(chǎn)物合成。

甘草是豆科多年生草本植物，除了重要的藥用價值，因具有抗寒、抗旱、抗鹽堿等優(yōu)良特性同時也是重要的草地資源之一。當前，甘草全基因組草圖序列已經(jīng)公布[22]，有助于進一步通過分子育種提高生物活性性狀和生產(chǎn)力。PRR基因促進植物生長發(fā)育，同時也響應(yīng)外界非生物脅迫，本研究獲得的7個PRR基因，從理化性質(zhì)、定位、基因結(jié)構(gòu)、進化分析等方面初步鑒定屬于甘草PRR基因。但PRR家族基因成員目前僅在模式植物擬南芥中研究較為廣泛，其結(jié)構(gòu)、功能以及表達模式仍然需要更加系統(tǒng)的研究，從而更全面地揭示PRR家族基因的分子機制，為今后研究甘草生長抗逆的分子機制提供科學(xué)依據(jù)。