王國寧, 張艷, 宋俊麗, 楊君, 王省芬, 吳立強, 張桂寅*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室，河北 保定 071001; 2.涿州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 涿州 072750)

棉花是重要的多用途經(jīng)濟作物，在世界范圍被廣泛種植。棉花生長發(fā)育過程中易遭受多種病菌危害而降低產(chǎn)量和纖維品質(zhì)，尤其黃萎病菌(Verticilliumdahliae)危害最為嚴(yán)重。黃萎病菌是一種土傳半營養(yǎng)型真菌，導(dǎo)致嚴(yán)重的黃萎病(Verticillium wilt)[1-2]。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類長度大于200 bp的非編碼RNA[3]，能夠在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達，在生長發(fā)育、病原菌防御等過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，TalncRNA18、TalncRNA73、TalncRNA106和TalncRNA1084對小麥條銹病脅迫應(yīng)答起重要調(diào)控作用[4]。油菜中發(fā)現(xiàn)一些lncRNA作為miRNA前體參與核盤菌脅迫應(yīng)答[5]。擬南芥lncRNA ELENA1通過調(diào)控PR1提高其對假單胞菌的抗性[6]。Jiang等[7]揭示番茄lncRNA23468通過抑制miR482b而影響NBS-LRRs的積累，最終提高番茄對晚疫病菌的抗性。

近些年來，棉花根組織中發(fā)現(xiàn)大量lncRNA響應(yīng)黃萎病菌侵染。Zhang等[2]通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，抗病海島棉和感病陸地棉中分別有1 236和1 907條lncRNA參與根組織對黃萎病菌脅迫應(yīng)答。本課題組前期對抗病陸地棉轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，4 277條lncRNA參與根組織拮抗黃萎病菌侵染[8]。黃萎病菌侵染根組織后，通過莖組織擴展至葉，并伴隨病癥的發(fā)生。Bae等[9]研究發(fā)現(xiàn)，黃萎病菌在不同抗性馬鈴薯品種莖組織中的擴展速度不同，表明莖組織在寄主拮抗黃萎病菌擴展中起重要作用。Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)，與感病陸地棉相比，抗病海島棉的莖部組織對黃萎病菌具有顯著的抑制作用。然而，棉花莖組織抗黃萎病相關(guān)lncRNA還未見報道。本研究通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)971條lncRNA參與莖組織拮抗黃萎病菌侵染，并對其功能機制進行了初步解析，為抗黃萎病相關(guān)lncRNA功能研究提供了理論依據(jù)，為棉花抗病性遺傳改良提供了新的見解。

1 材料與方法

1.1 植物材料與病原菌培養(yǎng)

供試棉花品種為抗病陸地棉農(nóng)大601，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花品種創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化團隊培育[11]。通過浸種、催芽處理的種子于10 h光照/14 h黑暗和25 ℃條件下的溫室進行培養(yǎng)。生長至4片真葉時，選取健康一致的幼苗進行黃萎病菌接種處理，同時以接水處理為對照組。本課題組前期鑒定的強致病力菌系臨西2-1[12]于PDA平板培養(yǎng)基上25 ℃活化培養(yǎng)15 d，轉(zhuǎn)接到Czapek培養(yǎng)液中，25 ℃震蕩(130 r·min-1)培養(yǎng)10 d左右，將孢子懸浮液濃度稀釋到1.0×107個孢子·mL-1，現(xiàn)配現(xiàn)用。

Czapek培養(yǎng)液配方：NaNO33 mg·mL-1，KH2PO41 mg·mL-1，MgSO41 mg·mL-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 mg·mL-1，KCl 1 mg·mL-1，蔗糖30 mg·mL-1。

1.2 RNA提取與測序

根據(jù)前期對黃萎病菌侵染過程的研究結(jié)果[10]，分別于接種處理后2、6、12、24和48 h(hpi, hours post infection)取棉花莖組織，分別命名為VD2hpi、VD6hpi、VD12hpi、VD24hpi和VD48hpi；同時接水處理組相應(yīng)時間點棉花莖組織也被收取(MT2hpi、MT6hpi、MT12hpi、MT24hpi和 MT48hpi)。利用RNA prep Pure Plant Kit試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取棉花莖組織總RNA，使用Ribo-zero rRNA Removal Kit試劑盒(美國Epicentre公司)去除rRNA，應(yīng)用NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit試劑盒(美國NEB公司)構(gòu)建cDNA文庫，采用Illumina Hiseq 4000平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3 lncRNA鑒定

為保證后續(xù)組裝質(zhì)量，提高生物信息分析結(jié)果的科學(xué)性，將原始數(shù)據(jù)去除含接頭、含ploy-N reads和低質(zhì)量的reads，獲得高質(zhì)量的clean reads。采用TopHat2[13]將clean reads對齊到棉花參考基因組[14]，已比對上的clean reads用Cufflinks[15]進行組裝和FPKM(Fragments Per Kilobase of exon per Million fragments mapped)分析。依據(jù)lncRNA特征，對完成組裝的轉(zhuǎn)錄本進行篩選和質(zhì)量控制：①去除長度<200 bp轉(zhuǎn)錄本；②通過Cuffcompare軟件篩除與數(shù)據(jù)庫注釋外顯子區(qū)域有重疊的轉(zhuǎn)錄本；③去除FPKM<0.5的轉(zhuǎn)錄本；④去除具有編碼潛能的轉(zhuǎn)錄本。

1.4 lncRNA差異表達及功能分析

使用Cuffdiff軟件對lncRNA進行差異表達分析，篩選閾值設(shè)定為q值<0.05，且差異倍數(shù)≥2。q值為校正后的p值。為了闡明lncRNA的生物學(xué)功能，對差異表達lncRNA進行順式和反式靶基因預(yù)測，采用KOBAS 3.00(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)對靶基因進行GO富集分析。lncRNA上、下游100 kb內(nèi)的mRNA通過STEM軟件進行篩選，得到順式靶基因。采用Pearson相關(guān)系數(shù)法分析lncRNA與mRNA表達水平的相關(guān)性，以相關(guān)系數(shù)絕對值>0.95為閾值，篩選反式靶基因。利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)搜索候選lncRNA靶基因在其他植物中的同源基因的功能，以預(yù)測靶基因在棉花植株中的功能。

1.5 qPCR

使用RNA prep Pure Plant Kit試劑盒提取高質(zhì)量總RNA。各樣本分別取0.5 μg總RNA，利用PrimeScript RT-PCR kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。利用Oligo 7設(shè)計特異性引物(表1)，采用SYBR?PremixExTaqTMⅡ?qū)崟r定量試劑盒，在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行擴增與基因表達定量分析。設(shè)置反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，55～60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)40次。每個樣品檢測3次生物學(xué)重復(fù)，基因表達水平以GhUBQ14為內(nèi)參進行歸一化處理[16]。

表1 qPCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 獲得971條棉花莖lncRNA響應(yīng)黃萎病菌脅迫

不同處理不同時間點的10個樣本轉(zhuǎn)錄組測序共獲得1 164 310 812條reads，從中篩選得到1 126 308 443條clean reads。84.0%～90.5% clean reads比對到參考基因組(表2)。通過組裝、篩選共得到12 772條lncRNA。使用Cuffdiff軟件對lncRNA進行差異表達分析，共篩選出971條差異表達lncRNA(圖1)。

圖1 差異表達lncRNA誘導(dǎo)表達譜

表2 棉花莖組織測序數(shù)據(jù)

2.2 差異表達lncRNA響應(yīng)黃萎病菌的時序性

從圖2可以看出，差異表達lncRNA隨黃萎病菌侵染進程而變化，下調(diào)表達lncRNA較上調(diào)表達lncRNA變化更為顯著。整體趨勢為響應(yīng)黃萎病菌侵染的lncRNA數(shù)量隨時間逐漸增多，至24 h達到高峰，48 h開始減少。進一步分析發(fā)現(xiàn)，接菌后不同時間點間存在高比例特異性差異表達lncRNA，尤其24 h達到67.18%。表明棉花莖組織lncRNA響應(yīng)黃萎病菌侵染具有明顯的時序性。

圖2 差異表達lncRNA特征

2.3 lncRNA對靶基因的調(diào)控方式

lncRNA能夠通過順式作用和反式作用調(diào)控靶基因表達[17]，因此預(yù)測了差異表達lncRNA的順式靶基因和反式靶基因。共鑒定108條lncRNA靶調(diào)控314條mRNA，構(gòu)成580對lncRNA-mRNA調(diào)控關(guān)系。其中23對為順式作用，557對為反式作用，表明抗病相關(guān)lncRNA對靶mRNA的調(diào)控方式以反式作用為主。通過對lncRNA和mRNA之間調(diào)控關(guān)系的研究，檢測到40條lncRNA調(diào)控作用較為簡單，每條lncRNA只調(diào)控1條mRNA；其余68條lncRNA調(diào)控作用較復(fù)雜，每條lncRNA能夠靶向調(diào)控多條mRNA(圖3)。相關(guān)性分析顯示，17個順式lncRNA正調(diào)控靶基因，5個順式lncRNA負調(diào)控靶基因，而反式lncRNA均正調(diào)控靶mRNA。這些結(jié)果表明，lncRNA主要通過反式正調(diào)控作用影響靶mRNA表達，參與棉花莖組織抵御黃萎病菌侵染。

圖3 差異表達lncRNA對mRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO富集分析

為解析差異表達lncRNA的潛在功能，對其靶mRNA進行了GO富集分析。GO注釋可分為生物過程、細胞組分和分子功能三類。生物過程類別中，主要富集到對幾丁質(zhì)、缺水、缺氧等刺激應(yīng)答反應(yīng)，JA、ABA等植物激素應(yīng)答反應(yīng)，對真菌的防御反應(yīng)和植物型超敏反應(yīng)；細胞組分中，細胞膜、細胞壁、胞間連絲、葉綠體、過氧化物酶體、細胞胞液、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等被顯著富集；分子功能主要包括脫氫酶、脫水酶、激酶、轉(zhuǎn)移酶等酶活性，DNA結(jié)合、血紅素結(jié)合、鈣調(diào)素結(jié)合、蛋白結(jié)合等結(jié)合功能(圖4)。以上結(jié)果表明，棉花莖組織差異表達lncRNA通過多種分子功能響應(yīng)由黃萎病菌誘導(dǎo)的各種脅迫和激素信號。

2.5 候選lncRNA功能分析

大量研究表明，轉(zhuǎn)錄因子、激酶和細胞色素P450家族蛋白在植物生長發(fā)育和抗逆反應(yīng)中起重要作用，本研究結(jié)果顯示，激酶、轉(zhuǎn)錄因子和血紅素結(jié)合GO條目被顯著富集(圖4)。為此進一步對靶調(diào)控這三類基因的18條lncRNA進行了深入分析。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，除了lnc_004530、lnc_004943和lnc_013707外，這些候選lncRNA受黃萎病菌誘導(dǎo)表達模式為：2～24 hpi上調(diào)表達或變化不顯著，48 hpi下調(diào)表達或變化不顯著(圖5)。

圖4 差異表達lncRNA靶基因GO富集分析

注：“In”表示誘導(dǎo)表達；“Lo”表示喪失表達。

2.5.1對激酶基因的調(diào)控作用 激酶在植物抗逆信號傳遞中起重要作用。通過對差異表達lncRNA靶基因注釋分析，鑒定出15條lncRNA正調(diào)控CDPK、CRK、LECRK和WAK等32個激酶基因(圖3，表3)。利用UniProt數(shù)據(jù)庫搜索這些激酶基因的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LecRK-IX.1、CDPK4、CRK5和CRK6在擬南芥等植物中的同源基因，通過調(diào)控H2O2積累、細胞程序性死亡、病程相關(guān)基因表達、氣孔運動等過程參與植物抗病。而CRK10、CRK15與CRK4、CRK5、CRK6屬于同一CRK亞家族[18]?；谝陨辖Y(jié)果，推測lnc_010753、lnc_004943、lnc_001364、lnc_003725、lnc_001285通過調(diào)節(jié)LecRK-IX.1、CRK10、CRK15和CDPK4等激酶基因的表達，激活下游一系列抗逆反應(yīng)，最終增強棉花莖組織對黃萎病菌的抗性(圖6)。

圖6 候選lncRNA通過調(diào)節(jié)激酶基因表達介導(dǎo)棉花抗黃萎病的潛在機制

表3 部分候選lncRNA對激酶基因表達的調(diào)控作用

2.5.2對轉(zhuǎn)錄因子基因的調(diào)控作用 本研究共鑒定9條lncRNA對ERF、NAC和WRKY等25個轉(zhuǎn)錄因子基因具有潛在的反式正調(diào)控作用(圖3，表4)。利用UniProt數(shù)據(jù)庫搜索這些轉(zhuǎn)錄因子的功能發(fā)現(xiàn)，WRKY6、WRKY33、ERF1A和NAC072轉(zhuǎn)錄因子，在擬南芥等植物中通過激活抗病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄提高植物抗病性。依據(jù)這些結(jié)果，推測lnc_004653、lnc_004530、lnc_007238、lnc_001285和lnc_013701通過調(diào)節(jié)WRKY6、WRKY33、ERF1A和NAC072轉(zhuǎn)錄因子基因的表達，激活下游抗逆基因的轉(zhuǎn)錄，最終增強棉花莖組織對黃萎病菌的抗性(圖7)。

圖7 候選lncRNA通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子基因表達介導(dǎo)棉花抗黃萎病的潛在機制

表4 部分候選lncRNA對轉(zhuǎn)錄因子基因表達的調(diào)控作用

2.5.3對細胞色素P450基因的調(diào)控作用 本研究發(fā)現(xiàn)，lnc_003725、lnc_004943、lnc_001285、lnc_007238、lnc_011764、lnc_004530通過反式作用正調(diào)控CYP710、CYP71、CYP82和CYP75等9個細胞色素P450家族基因(圖3，表5)。利用UniProt數(shù)據(jù)庫查詢這些細胞色素P450的功能，發(fā)現(xiàn)CYP710A1和CYP75B1分別催化合成抗病相關(guān)物質(zhì)豆甾醇和槲皮素。大豆CYP82A3正調(diào)控病程相關(guān)基因PR3和PR4的表達[19]。根據(jù)以上結(jié)果推測，lnc_003725、lnc_004943、lnc_001285、lnc_007238、lnc_011764和lnc_004530正調(diào)控CYP82A3、CYP710A1和CYP75B1基因表達，進而上調(diào)抗病相關(guān)基因PR3和PR4表達或催化抗病物質(zhì)的合成，提高棉花對黃萎病菌的抗性(圖8)。

注：B—β-谷甾醇；S—豆甾醇；D—二氫山萘酚；Q—槲皮素。

表5 部分候選lncRNA對細胞色素P450基因表達的調(diào)控作用

2.6 qPCR驗證

2.6.1lncRNA驗證 為了進一步驗證抗黃萎病相關(guān)lncRNA的表達，選取分別與激酶、轉(zhuǎn)錄因子和細胞色素P450基因表達相關(guān)的 lnc_011764、lnc_010753和lnc_013707進行qPCR定量分析。結(jié)果顯示，黃萎病菌脅迫下lnc_011764在2、6、12和24 hpi顯著上調(diào)表達，48 hpi顯著下調(diào)表達；lnc_010753在2 hpi顯著上調(diào)表達，48 hpi顯著下調(diào)表達；lnc_013707在6 hpi顯著下調(diào)表達，12和24 hpi顯著上調(diào)表達(圖9)。這些結(jié)果進一步揭示了lnc_011764、lnc_010753和lnc_013707參與棉花對黃萎病菌的防御反應(yīng)。此外，qPCR檢測結(jié)果與高通量測序結(jié)果基本一致(圖5和9)，表明基于高通量測序的表達量分析結(jié)果質(zhì)量較高。

2.6.2靶mRNA驗證 根據(jù)lncRNA-mRNA靶關(guān)系預(yù)測結(jié)果，挑選lnc_011764、lnc_010753及l(fā)nc_013707的靶基因Gh_D05G2983、Gh_D05G1893、Gh_D13G0477和Gh_D13G0071進行qPCR分析。結(jié)果顯示，Gh_D05G2983在2、6和12 hpi顯著上調(diào)表達，48 hpi顯著下調(diào)表達；Gh_D05G1893在2、6、12和24 hpi顯著上調(diào)表達，48 hpi顯著下調(diào)表達；Gh_D13G0477在2、6和12 hpi顯著上調(diào)表達，48 hpi顯著下調(diào)表達；Gh_D13G0071在12 hpi顯著上調(diào)表達(圖10)。對比圖10和圖9發(fā)現(xiàn)，Gh_D13G0071與其靶調(diào)控子lnc_013707的誘導(dǎo)表達規(guī)律不一致，Gh_D05G1893、Gh_D05G2983分別與lnc_011764及Gh_D13G0477與lnc_010753表達規(guī)律基本一致。這些結(jié)果為進一步研究lnc_011764與lnc_010753的抗病機制奠定了理論基礎(chǔ)。

3 討論

長鏈非編碼RNA(lncRNA)作為一類重要的調(diào)控分子，通過多種機制廣泛參與植物的生長發(fā)育和抗逆反應(yīng)等生物過程[17, 20]。近些年，棉花中也報道了大量與纖維發(fā)育、生物脅迫和非生物脅迫相關(guān)lncRNA[2, 8, 21-24]。棉花黃萎病菌是一種廣泛存在、極具破壞性的土傳真菌病害，對棉纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響。黃萎病菌首先攻擊寄主的根組織，因此前期研究主要集中在棉花根組織lncRNA對黃萎病菌的抗性。然而不少研究表明，莖組織在寄主拮抗黃萎病菌擴展過程中起重要作用，因此研究莖組織lncRNA的抗病功能亦十分重要。本研究首次表征了莖組織lncRNA在抗黃萎病過程中的重要作用。

黃萎病菌對植物的侵染包括根際附著、定植、孢子萌發(fā)、新菌絲延伸及向上部莖、葉組織擴展等過程，植物同時也進行一系列復(fù)雜有序的調(diào)控機制進行免疫反應(yīng)[8-10, 25-26]。本研究顯示，莖組織在抵抗黃萎病菌侵染過程中具有明顯的時序性(圖2)。與本實驗室前期根組織抗病相關(guān)lncRNA進行比較，發(fā)現(xiàn)有474條(48.82%)lncRNA只在莖組織被誘導(dǎo)表達，表明棉花lncRNA在抵抗黃萎病菌侵染時具有時空特異性。因此，組織特異性誘導(dǎo)表達lncRNA和非特異性誘導(dǎo)表達lncRNA的抗病功能和機制可待進一步深入研究。

近些年研究鑒定了大量植物lncRNA，但具體功能大多還不十分清楚。本研究利用lncRNA靶基因進行GO富集分析，以幫助了解lncRNA潛在的抗病功能。并揭示了lncRNA在胞內(nèi)、胞外和細胞膜多種細胞組分，通過多種機制響應(yīng)病原菌誘導(dǎo)的各類刺激及激素信號，參與棉花對黃萎病菌的免疫反應(yīng)。同時響應(yīng)細菌、冷等生物、非生物脅迫的防御反應(yīng)也被顯著富集(未列出)，表明部分抗黃萎病相關(guān)lncRNA可能具有多抗性。另外，莖組織抗病相關(guān)lncRNA的數(shù)量顯著少于根組織[8]，推測經(jīng)過根組織對黃萎病菌的識別與互作，莖組織對病菌響應(yīng)的目標(biāo)性更強，可減少不必要的能量消耗，這更有利于寄主的存活。

本研究發(fā)現(xiàn)，lnc_004943等5條lncRNA對激酶CDPK4、CRK10、CRK15和LecRK_IX.1的編碼基因具有潛在的調(diào)控作用；lnc_004653等5條lncRNA潛在調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子WRKY6、WRKY33、ERF1A和NAC072的編碼基因；lnc_007238等6條lncRNA通過反式作用正調(diào)控CYP82A3、CYP75B1和CYP710A1編碼基因的表達(表2～4)。利用UniProt數(shù)據(jù)庫對這些靶基因進行了功能預(yù)測，結(jié)果表明這些靶基因具有潛在抗病功能。據(jù)報道馬鈴薯CDPK4和CDPK5通過RBOH調(diào)節(jié)活性氧(reactive oxygen species，ROS)簇參與植物免疫[27]。LecRK-IX.1可誘導(dǎo)H2O2積累和細胞死亡，介導(dǎo)擬南芥對疫霉(Phytophthora)的抗性[28]。CRK5可正調(diào)控PR1表達并激活超敏反應(yīng)引起的細胞死亡，提高擬南芥對丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的抗性[29]；CRK4和CRK6通過調(diào)節(jié)ROS積累和氣孔關(guān)閉，增強擬南芥對病原菌的免疫作用[30]；而CRK10、CRK15與CRK4、CRK5、CRK6屬于同一CRK亞家族[18]。研究表明，擬南芥WRKY33通過激活類滲調(diào)蛋白(OLP)和PR3基因表達介導(dǎo)擬南芥抵御灰霉病菌(Botrytiscinerea)和黑斑病菌(Alternariabrassicicola)[31]。擬南芥WRKY6通過NPR1正調(diào)控病原菌防御基因PR1[32]。擬南芥乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子ERF1通過堿性幾丁質(zhì)酶(CHIT-B/PR3)響應(yīng)丁香假單胞菌[33]。擬南芥NAC072可能通過調(diào)控EDR1響應(yīng)缺水脅迫[34]。據(jù)報道，大豆CYP82A3通過正調(diào)控PR3和PR4基因表達，提高轉(zhuǎn)基因煙草對寄生疫霉(P.parasitica)的抗性[19]。擬南芥CYP710A1可催化β-谷甾醇合成豆甾醇，進而提高寄主對丁香假單胞菌的抗性[35-37]。CYP75B1可催化二氫山萘酚合成槲皮素[38]，而槲皮素具有真菌抗性[39]。結(jié)合這些激酶、轉(zhuǎn)錄因子和細胞色素P450家族基因的已有報道，本研究構(gòu)建了lnc_004943、lnc_004653、lnc_007238等10條棉花莖組織lncRNA可能的抗病機制簡圖(圖7～8)。采用qPCR技術(shù)分別對lnc_010753、lnc_013707和lnc_011764的靶基因進行了定量分析，結(jié)果進一步揭示了lnc_011764對棉花CYP82A3(Gh_D05G1893、Gh_D05G2983)及l(fā)nc_010753對棉花LecRK-IX.1(Gh_D13G0477)具有潛在的調(diào)控作用；而lnc_013707與預(yù)測靶基因Gh_D13G0071的誘導(dǎo)表達規(guī)律不相同，可能是因為lnc_013707不是Gh_D13G0071的主要調(diào)控因子，是否存在其他主效調(diào)控因子有待進一步研究。本研究為深度解析這些lncRNA的抗病機理提供了重要理論依據(jù)，將通過過表達和沉默實驗進一步驗證lncRNA功能。