鄭良良，張弛

(金華市中心醫(yī)院，浙江 金華 321000)

神經(jīng)損傷包括中樞神經(jīng)損傷和外周神經(jīng)損傷，坐骨神經(jīng)損傷是常見的外周神經(jīng)損傷，多由慢性疾病導(dǎo)致[1-2]。神經(jīng)損傷的修復(fù)始終是臨床上的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題。目前，臨床常采用電療法、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)藥物療法及干細(xì)胞移植療法等[3-4]。干細(xì)胞具有多向分化潛能，如人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells，hUCB-MSCs)可以分化為脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等[5-6]。但干細(xì)胞易老化且分化方向不易控制，限制了干細(xì)胞在神經(jīng)損傷修復(fù)中的廣泛應(yīng)用[7-8]。外泌體(exosome，Exo)是一類由細(xì)胞分泌的具有雙層磷脂結(jié)構(gòu)的囊泡，其攜帶大量遺傳物質(zhì)，能夠通過膜融合和胞吞的方式，將遺傳信息傳遞至受體細(xì)胞中，影響受體細(xì)胞的增殖、分化[9-12]。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)是由神經(jīng)元分泌的重要生長(zhǎng)因子，能夠促進(jìn)神經(jīng)元增殖和分化。研究表明，NGF能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，具有保護(hù)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的作用[13]。為了探究NGF過表達(dá)的hUCB-MSCs來源Exo(NGF-hUCB-MSCs-Exo)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷(chronic constriction injury，CCI)的效果及作用機(jī)制，我們圍繞NGF-hUCB-MSCs-Exo開展了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料和儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料hUCB-MSCs(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)。雄性Sprague Dawley大鼠(浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，均為無特定病原體動(dòng)物，年齡(3.46±0.12)周，體質(zhì)量(255±32)g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SYXK(浙)2019-0024。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)金華市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查通過。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，非特異性兔抗鼠CD34、CD45、CD90和CD105一抗(英國(guó)Abcam公司)，熒光素標(biāo)記整合素avb3抗體免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G、多聚甲醛、磷鎢酸溶液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗、羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽、水合氯醛、增強(qiáng)型DAB顯色試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司)，基因合成引物、重組慢病毒載體由上海吉?jiǎng)P基因生物科技有限公司制備，放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液(上海梵態(tài)生物科技有限公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海吉至生化科技有限公司)，兔抗鼠CD63、CD9、CD81、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease，Caspase)-1、Caspase-3和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)一抗(英國(guó)Abcam公司)，SuperSignalTMWest Femto最大靈敏度底物(上海研卉生物科技有限公司)，PKH67熒光探針細(xì)胞膜染色試劑盒(上海西格生物科技有限公司)，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色液、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶、生物素化鼠抗地高辛(北京百奧萊博科技有限公司)，抗熒光淬滅劑(北京雷根生物技術(shù)有限公司)，4.0鉻制羊腸線(上海金環(huán)生物有限公司)，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒、蛋白酶K(北京索萊寶科技有限公司)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(北京碧云天試劑公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器流式細(xì)胞儀(美國(guó)NovoCyte公司)，倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，透射電子顯微鏡(北京歐波同光學(xué)技術(shù)有限公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(杭州申花科技有限公司)，IITC動(dòng)物熱痛刺激儀(美國(guó)IITC公司)。

2 方 法

2.1 hUCB-MSCs的鑒定取第2代hUCB-MSCs接種于25 mL培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞匯合率達(dá)到80%～90%時(shí)，向培養(yǎng)瓶中加入1 mL胰蛋白酶溶液(0.25%)，消化1～2 min后，加入1 mL含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)。輕輕吹打懸浮細(xì)胞后，轉(zhuǎn)入 5 mL 的無菌離心管，以1200 r·min-1(離心半徑：5 cm)離心8 min。去上清，PBS洗滌2次，用含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×106～1.0×107個(gè)·mL-1。取100 μL細(xì)胞液至EP管，依次加入非特異性兔抗鼠CD34、CD45、CD90和CD105一抗(稀釋比例為1∶5000)各100 μL，于室溫避光孵育35 min，以1200 r·min-1(離心半徑：5 cm)離心8 min。去上清，PBS洗滌2次，加入 500 μL PBS懸浮。加入20 μL熒光素標(biāo)記整合素avb3抗體IgG，常溫下避光孵育30 min，1200 r·min-1(離心半徑：5 cm)離心8 min，去上清，PBS洗滌3次。以PBS懸浮細(xì)胞，加入500 μL 1%多聚甲醛溶液，加入流式管中，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)hUCB-MSCs的表面蛋白CD34、CD45、CD90和CD105的表達(dá)。

2.2 重組慢病毒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

2.2.1NGF過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建 根據(jù)NGF基因序列(5’-TGGCTGGTCCT-3’)設(shè)計(jì)NGF基因合成引物：正義鏈為5’-ACCTGCCATTGCCT-3’，反義鏈為5’-TTGCTAGTGCCTCGA-3’。采用LV3載體構(gòu)建NGF過表達(dá)慢病毒載體，并進(jìn)行慢病毒包裝。

2.2.2重組慢病毒的轉(zhuǎn)染 取2 mL培養(yǎng)至第2代的hUCB-MSCs接種于6孔板中，于溫度37 ℃、CO2濃度5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合率達(dá)50%時(shí)，根據(jù)慢病毒轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，感染復(fù)數(shù)為50，慢病毒滴度為3.0×107轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(transducing units，TU)·mL-1。轉(zhuǎn)染72 h后，于倒置熒光顯微鏡下觀察并測(cè)定hUCB-MSCs轉(zhuǎn)染率，隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。hUCB-MSCs轉(zhuǎn)染率=熒光視野細(xì)胞數(shù)/白光視野細(xì)胞數(shù)×100%。

2.3 NGF-hUCB-MSCs-Exo的提取和鑒定

2.3.1NGF-hUCB-MSCs-Exo的提取 重組慢病毒轉(zhuǎn)染72 h，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入2 mL DMEM培養(yǎng)基，于溫度37 ℃、CO2濃度5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h。收集培養(yǎng)液，于4 ℃條件下以 300 r·min-1(離心半徑：5 cm)離心10 min；轉(zhuǎn)移上清于離心管，于4 ℃條件下以2000 r·min-1(離心半徑：5 cm)離心20 min；取上清，經(jīng)0.22 μm過濾器過濾后轉(zhuǎn)移至離心管中，于4 ℃條件下以10 000 r·min-1(離心半徑：5 cm)離心70 min；取沉淀，PBS洗滌1次，于4 ℃條件下以10 000 r·min-1(離心半徑：5 cm)離心70 min；小心棄去上清，即得到NGF-hUCB-MSCs-Exo沉淀，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2NGF-hUCB-MSCs-Exo形態(tài)的鑒定 在NGF-hUCB-MSCs-Exo沉淀中加入100 μL PBS重新懸浮NGF-hUCB-MSCs-Exo，取30 μL NGF-hUCB-MSCs-Exo懸液，置于載樣銅網(wǎng)上，室溫下靜置3 min，加入30 μL磷鎢酸溶液(3%)進(jìn)行染色，5 min 后棄去染色液，室溫下靜置至銅網(wǎng)干燥，采用透射電子顯微鏡觀察NGF-hUCB-MSCs-Exo形態(tài)。

2.3.3NGF-hUCB-MSCs-Exo標(biāo)志蛋白的鑒定分別取一定量的hUCB-MSCs懸液和NGF-hUCB-MSCs-Exo懸液于EP管，置于冰上預(yù)冷，采用RIPA裂解液分別提取hUCB-MSCs和NGF-hUCB-MSCs-Exo總蛋白。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白上樣量為30 μg，采用SDS-PAGE分離蛋白。電泳結(jié)束后，采用電轉(zhuǎn)移的方式將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯膜。將膜浸入封閉液中，在室溫下于搖床上封閉2 h；加入兔抗鼠CD63、CD9、CD81和GAPDH一抗(稀釋比例為1∶10000)，4 ℃ 過夜孵育；用TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗(稀釋比例為1∶2000)，室溫避光孵育10 min；用TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min；加入SuperSignalTMWest Femto最大靈敏度底物，于凝膠成像分析系統(tǒng)顯影并拍照。

2.4 hUCB-MSCs攝取內(nèi)化NGF-hUCB-MSCs-Exo的觀察在NGF-hUCB-MSCs-Exo沉淀中加入100 μL PBS重新懸浮NGF-hUCB-MSCs-Exo，加入4 μL PKH67熒光探針溶液，于室溫下孵育 10 min；加入1 mL的10%BSA溶液，采用超速離心法收集PKH67標(biāo)記的NGF-hUCB-MSCs-Exo以備用。將hUCB-MSCs分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，分別接種于預(yù)先鋪有蓋玻片的24孔板中，每孔接種300 μL細(xì)胞液(細(xì)胞濃度約1.0×106個(gè)·mL-1)，每組接種 3個(gè)復(fù)孔。待貼壁細(xì)胞占爬片面積的60%以上，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次。實(shí)驗(yàn)組中加入100 μL PKH67標(biāo)記的NGF-hUCB-MSCs-Exo混懸液，對(duì)照組加入100 μL PBS，置于溫度為37 ℃、CO2濃度5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12 h。孵育后加入10 μL的鬼筆環(huán)肽，室溫下避光孵育20 min，棄去染色劑，PBS洗滌3次，使用4%的多聚甲醛溶液固定30 min；再加入適量的DAPI染色液，室溫下避光孵育15 min；PBS洗滌3次；加入抗熒光淬滅劑，指甲油封片，于熒光顯微鏡下觀察。

2.5 NGF-hUCB-MSCs-Exo修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)CCI的觀察

2.5.1造模及模型鑒定方法 取大鼠20只，隨機(jī)取15只構(gòu)建坐骨神經(jīng)CCI模型，另外5只不做處理。于大鼠腹腔注射3%水合氯醛麻醉，用量0.4 mL·kg-1。麻醉后于右下肢背側(cè)做2 cm縱形切口，逐層切開皮膚、皮下組織，鈍性分離股二頭肌，暴露坐骨神經(jīng)主干。采用4.0鉻制羊腸線環(huán)扎坐骨神經(jīng)，環(huán)繞4圈，每圈間距1 mm，松緊度以單環(huán)恰可上下活動(dòng)為度；注意保護(hù)神經(jīng)外膜血供。碘伏消毒，逐層縫合切口。分別于術(shù)后第1天、第3天、第5天、第7天采用IITC動(dòng)物熱痛刺激儀測(cè)定大鼠機(jī)械刺激縮足反射閾值(paw withdrawal mechanical threshold，PWMT)和熱刺激縮足反射潛伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL)。

2.5.2Exo與hUCB-MSCs混合液的制備方法 根據(jù)方法2.2分別采用空載體慢病毒和重組慢病毒轉(zhuǎn)染hUCB-MSCs，并制備空載體慢病毒轉(zhuǎn)染hUCB-MSCs來源Exo(hUCB-MSCs-Exo)和NGF-hUCB-MSCs-Exo。取100 μL hUCB-MSCs-Exo和100 μL NGF-hUCB-MSCs-Exo分別與900 μL DMEM培養(yǎng)基混勻，分別加入至1 mL hUCB-MSCs(細(xì)胞濃度1.0×108個(gè)·mL-1)，制成Exo與hUCB-MSCs混合液。

2.5.3干預(yù)方法 造模成功后，取未做處理的5只大鼠為正常對(duì)照組，不做任何處理；將15只坐骨神經(jīng)CCI模型大鼠隨機(jī)分為坐骨神經(jīng)CCI模型組、hUCB-MSCs-Exo注射組和NGF-hUCB-MSCs-Exo注射組。坐骨神經(jīng)CCI模型組大鼠于尾靜脈注射1 mL PBS，hUCB-MSCs-Exo注射組大鼠于尾靜脈注射 1 mL hUCB-MSCs-Exo和hUCB-MSCs混合液，NGF-hUCB-MSCs-Exo注射組大鼠于尾靜脈注射1 mL NGF-hUCB-MSCs-Exo與hUCB-MSCs混合液。每周注射1次，連續(xù)注射3周。將所有大鼠于溫度20～25 ℃、相對(duì)濕度50%～65%條件下正常飼養(yǎng)。

2.6 NGF-hUCB-MSCs-Exo修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)CCI的效果評(píng)價(jià)

2.6.1病理學(xué)檢查方法 3周后處死大鼠，取L4～L5制備冷凍切片，切片厚度8μm，采用HE染色試劑盒進(jìn)行染色，于顯微鏡下觀察脊髓后角灰質(zhì)的病理變化。采用Allen脊髓后角灰質(zhì)病變?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[14]進(jìn)行評(píng)分：0分，未觀察到病變；1分，灰質(zhì)中含有1～5個(gè)嗜酸性神經(jīng)元；2分，灰質(zhì)中含有6～10個(gè)嗜酸性神經(jīng)元；3分，灰質(zhì)中含有10個(gè)以上嗜酸性神經(jīng)元；4分，灰質(zhì)梗死灶面積<灰質(zhì)面積的1/3；5分，灰質(zhì)面積的1/3≤灰質(zhì)梗死灶面積<灰質(zhì)面積的1/2；6分，灰質(zhì)梗死灶面積≥灰質(zhì)面積的1/2。

2.6.2細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法 采用TUNEL染色法評(píng)估L4～L5脊髓組織的細(xì)胞凋亡情況。取L4～L5制備冷凍切片，放置于載玻片，采用4%多聚甲醛固定 30 min，PBS洗滌3次，每次5 min。加入一定量的含有20 μg·mL-1蛋白酶K溶液，于室溫下孵育 15 min，PBS洗滌3次，每次5 min。加入3%H2O2溶液孵育5 min，PBS洗滌3次，每次5 min。再加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶緩沖液孵育1 h，PBS洗滌3次，每次5 min。再加入生物素化鼠抗地高辛溶液孵育 30 min，PBS洗滌3次，每次5 min。采用增強(qiáng)型DAB顯色試劑盒顯色。于顯微鏡下觀察，隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總數(shù)及凋亡細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.6.3炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的蛋白表達(dá)分析方法 收集各組大鼠脊髓組織各1 mg，分別加入 1 mL RIPA裂解液，于冰上裂解30 min。轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 離心管，在4 ℃下以5000 r·min-1(離心半徑：10 cm)離心5 min；取上清，在4 ℃下以12 000 r·min-1(離心半徑：10 cm)離心10 min；取沉淀，加入100 μL PBS重懸后，取1 μL重懸液測(cè)定蛋白濃度，剩余加入上樣緩沖液，采用SDS-PAGE分離蛋白。將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，加入2 mL 5%脫脂奶粉溶液封閉30 min，分別加入100 μL兔抗鼠NLRP3、IL-1β、Caspase-1、Caspase-3和β-actin一抗稀釋液(稀釋比例1∶10 000)于封閉液中，于4 ℃避光孵育過夜。PBST洗膜3次，每次5 min。將ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒中的A液和B液等比例混合后，加在膜上進(jìn)行顯色。拍照后采用Image-J圖像處理軟件處理圖片，提取蛋白條帶灰度值，比較蛋白表達(dá)水平。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。坐骨神經(jīng)CCI模型大鼠與正常大鼠不同時(shí)間點(diǎn)PMWT、PWTL的組間比較均采用t檢驗(yàn)；正常對(duì)照組、坐骨神經(jīng)CCI模型組、hUCB-MSCs-Exo注射組和NGF-hUCB-MSCs-Exo注射組大鼠Allen脊髓后角灰質(zhì)病變?cè)u(píng)分、脊髓組織細(xì)胞凋亡率以及脊髓組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1、Caspase-3的蛋白表達(dá)量的組間比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較均采用q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié) 果

3.1 hUCB-MSCs鑒定結(jié)果流式細(xì)胞儀檢測(cè)第2代hUCB-MSCs，CD34陽(yáng)性率0.4%，CD45陽(yáng)性率0.6%，CD90陽(yáng)性率95.8%，CD105陽(yáng)性率98.3%，符合hUCB-MSCs表面蛋白表達(dá)特征。

3.2 重組慢病毒轉(zhuǎn)染hUCB-MSCs結(jié)果重組慢病毒轉(zhuǎn)染72 h，hUCB-MSCs轉(zhuǎn)染率(89.22±6.91)%(圖1)。

圖1 重組慢病毒轉(zhuǎn)染72 h后的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(×400)

3.3 NGF-hUCB-MSCs-Exo鑒定結(jié)果透射電子顯微鏡結(jié)果顯示，NGF-hUCB-MSCs-Exo為杯口狀結(jié)構(gòu)(圖2)。蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，NGF-hUCB-MSCs-Exo標(biāo)志蛋白CD63、CD9和CD81表達(dá)量高于hUCB-MSCs，表明Exo提取成功(圖3)。

圖2 透射電子顯微鏡下的外泌體(×200 000)

GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；①人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞；②神經(jīng)生長(zhǎng)因子過表達(dá)人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體。

3.4 hUCB-MSCs攝取及內(nèi)化NGF-hUCB-MSCs-Exo觀察結(jié)果hUCB-MSCs與NGF-hUCB-MSCs-Exo共培養(yǎng)12 h后，觀察到hUCB-MSCs攝取并內(nèi)化NGF-hUCB-MSCs-Exo(圖4)。

3.5 大鼠坐骨神經(jīng)CCI模型鑒定結(jié)果術(shù)后第1天、第3天、第5天、第7天，坐骨神經(jīng)CCI模型大鼠的PWMT和PWTL均低于正常大鼠，表明造模成功(表1)。

3.6 病理學(xué)檢查結(jié)果正常對(duì)照組、坐骨神經(jīng)CCI模型組、hUCB-MSCs-Exo注射組和NGF-hUCB-MSCs-Exo注射組大鼠Allen脊髓后角灰質(zhì)病變?cè)u(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(0.32±0.04)分，(4.21±0.11)分，(4.09±0.15)分，(1.89±0.17)分，F(xiàn)=11.714，P=0.000]。坐骨神經(jīng)CCI模型組、hUCB-MSCs-Exo注射組和NGF-hUCB-MSCs-Exo注射組大鼠Allen脊髓后角灰質(zhì)病變?cè)u(píng)分均高于正常對(duì)照組(q=2.783，P=0.015；q=3.921，P=0.000；q=3.784，P=0.000)；hUCB-MSCs-Exo注射組和NGF-hUCB-MSCs-Exo注射組大鼠Allen脊髓后角灰質(zhì)病變?cè)u(píng)分均低于坐骨神經(jīng)CCI模型組(q=2.059，P=0.024；q=2.071，P=0.021)；NGF-hUCB-MSCs-Exo注射組大鼠Allen脊髓后角灰質(zhì)病變?cè)u(píng)分低于hUCB-MSCs-Exo注射組(q=2.809，P=0.013)。見圖5。

3.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果正常對(duì)照組、坐骨神經(jīng)CCI模型組、hUCB-MSCs-Exo注射組和NGF-hUCB-MSCs-Exo注射組大鼠脊髓組織細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(0.15±0.02)%，(8.98±0.37)%，(8.14±0.29)%，(3.46±0.31)%，F(xiàn)=9.908，P=0.012]。坐骨神經(jīng)CCI模型組、hUCB-MSCs-Exo注射組和NGF-hUCB-MSCs-Exo注射組大鼠脊髓組織細(xì)胞凋亡率均高于正常對(duì)照組(q=2.142，P=0.017；q=3.287，P=0.000；q=2.275，P=0.025)；hUCB-MSCs-Exo注射組和NGF-hUCB-MSCs-Exo注射組大鼠脊髓組織細(xì)胞凋亡率均低于坐骨神經(jīng)CCI模型組(q=2.021，P=0.021；q=2.086，P=0.024)；NGF-hUCB-MSCs-Exo注射組大鼠脊髓組織細(xì)胞凋亡率低于hUCB-MSCs-Exo注射組(q=3.008，P=0.011)。見圖6。

圖4 熒光顯微鏡下間充質(zhì)干細(xì)胞攝取及內(nèi)化外泌體觀察結(jié)果(×800)

表1 2組大鼠術(shù)后機(jī)械刺激縮足反射閾值和熱刺激縮足反射潛伏期

CCI：慢性壓迫損傷；hUCB-MSCs：人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞；Exo：外泌體；NGF：神經(jīng)生長(zhǎng)因子。

3.8 炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的蛋白表達(dá)分析結(jié)果正常對(duì)照組、坐骨神經(jīng)CCI模型組、hUCB-MSCs-Exo注射組和NGF-hUCB-MSCs-Exo注射組大鼠脊髓組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和Caspase-3蛋白表達(dá)量比較，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。坐骨神經(jīng)CCI模型組、hUCB-MSCs-Exo注射組和NGF-hUCB-MSCs-Exo注射組大鼠脊髓組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和Caspase-3蛋白表達(dá)量均高于正常對(duì)照組(坐骨神經(jīng)CCI模型組：q=3.709，P=0.000；q=3.328，P=0.000；q=3.145，P=0.000；q=2.974；P=0.000；hUCB-MSCs-Exo注射組：q=2.893，P=0.019；q=2.944，P=0.013；q=3.008，P=0.009；q=3.852，P=0.000；NGF-hUCB-MSCs-Exo注射組：q=2.428，P=0.022；q=4.903，P=0.000；q=3.884，P=0.000；q=4.382，P=0.000)；hUCB-MSCs-Exo注射組和NGF-hUCB-MSCs-Exo注射組大鼠脊髓組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和Caspase-3蛋白表達(dá)量均低于坐骨神經(jīng)CCI模型組(hUCB-MSCs-Exo注射組：q=3.609，P=0.000；q=3.811，P=0.000；q=3.476，P=0.000；q=3.889，P=0.000；NGF-hUCB-MSCs-Exo注射組：q=2.338，P=0.000；q=3.098，P=0.000；q=2.358，P=0.000；q=3.775，P=0.000)；NGF-hUCB-MSCs-Exo注射組大鼠的脊髓組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和Caspase-3蛋白表達(dá)量均低于hUCB-MSCs-Exo注射組(q=3.798，P=0.000；q=3.573，P=0.000；q=2.998，P=0.000；q=3.208，P=0.000)。見表2、圖7。

4 討 論

神經(jīng)損傷的原因包括直接暴力和慢性疾病，其中腰椎間盤突出癥、梨狀肌綜合征、肘管綜合征等是導(dǎo)致神經(jīng)損傷的常見慢性損傷性疾病[15-16]。神經(jīng)損傷嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，而神經(jīng)損傷的修復(fù)較為緩慢，研究表明在無張力條件下神經(jīng)損傷的最快修復(fù)速度是1～2 nm·d-1[17-18]。NGF是由神經(jīng)元分泌的生長(zhǎng)因子，是由α、β、λ 3個(gè)亞基構(gòu)成的蛋白三聚體；

CCI：慢性壓迫損傷；hUCB-MSCs：人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞；Exo：外泌體；NGF：神經(jīng)生長(zhǎng)因子。

表2 4組大鼠脊髓組織中炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)量

NLRP3：NOD樣受體蛋白3；IL：白細(xì)胞介素；Caspase：兔抗鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；β-actin：β-肌動(dòng)蛋白；①為正常對(duì)照組；②為坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷模型組；③為人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體注射組；④為神經(jīng)生長(zhǎng)因子過表達(dá)人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體注射組。

其中β亞基與神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)和再生密切相關(guān)[19]。研究表明，NGF可以與Trk蛋白相結(jié)合，通過MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化[20]。干細(xì)胞具有多向分化潛能，在特定條件誘導(dǎo)下可向神經(jīng)細(xì)胞分化，但NGF過表達(dá)干細(xì)胞存在易老化、傳代后分化方向不確定等不足，難以充分發(fā)揮NGF的誘導(dǎo)作用。因此，從NGF過表達(dá)干細(xì)胞中提取Exo，可以利用Exo攜帶NGF基因信息的特點(diǎn)發(fā)揮長(zhǎng)期誘導(dǎo)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的作用。我們通過構(gòu)建NGF過表達(dá)慢病毒載體，通過慢病毒將NFG基因?qū)雋UCB-MSCs，并成功提取NGF-hUCB-MSCs-Exo，將NGF-hUCB-MSCs-Exo與hUCB-MSCs注入坐骨神經(jīng)損傷的大鼠體內(nèi)，發(fā)揮NGF誘導(dǎo)hUCB-MSCs向神經(jīng)元分化的作用，進(jìn)而修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)損傷。研究結(jié)果表明，NGF-hUCB-MSCs-Exo能夠抑制脊髓后角灰質(zhì)發(fā)生病變、降低脊髓組織細(xì)胞凋亡率、抑制脊髓組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和Caspase-3等蛋白的表達(dá)，發(fā)揮修復(fù)神經(jīng)損傷的作用，為臨床神經(jīng)損傷的治療提供新的思路和方法。

坐骨神經(jīng)損傷與神經(jīng)組織中炎癥因子的表達(dá)關(guān)系密切。陳亞軍等[21]研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子能夠刺激大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)NLRP3炎癥小體，進(jìn)而引起大鼠神經(jīng)性疼痛加劇。IL-1是由單核細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，能促進(jìn)免疫應(yīng)答，參與炎癥反應(yīng)；其中IL-1β作為NLRP3的下游因子，可通過NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路介導(dǎo)小鼠急性脊髓損傷的炎性疼痛反應(yīng)[22]。Caspase家族是一類結(jié)構(gòu)相似的蛋白水解酶，具有較高的同源性，在細(xì)胞程序性死亡過程中發(fā)揮著重要作用。Caspase-1是參與炎癥反應(yīng)信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，其作為NLRP3的下游分子，在炎性反應(yīng)的傳遞中發(fā)揮重要作用[23-24]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其可被炎癥反應(yīng)、機(jī)械損傷等多種因素刺激而活化[25]。本研究結(jié)果表明，NGF-hUCB-MSCs-Exo注射組大鼠脊髓組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于坐骨神經(jīng)CCI模型組和hUCB-MSCs-Exo注射組，提示NGF-hUCB-MSCs-Exo能夠顯著抑制坐骨神經(jīng)CCI大鼠脊髓組織中的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果表明，NGF-hUCB-MSCs-Exo治療大鼠坐骨神經(jīng)CCI，能夠抑制脊髓后角灰質(zhì)病變和脊髓細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制NLRP3、IL-1β、Caspase-1和Caspase-3的表達(dá)有關(guān)。