黎桂英,王兆豐,張 婭,李嘉敏,蔣曉煜,楊穎麗

西北師范大學生命科學學院, 蘭州 730070

隨著工業(yè)化進程的加快,我國環(huán)境遭到嚴重污染。《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示,我國土壤總污染率為16%,其中重金屬污染約占全部污染的82%,尤以鎘污染為重[1]。《中國生態(tài)環(huán)境狀況公報》中也指出,重金屬是影響農(nóng)用土壤環(huán)境質(zhì)量的主要污染物,其中鎘為首要污染物[2]。過量的鎘不僅對植物的生長發(fā)育造成嚴重的破環(huán)[3- 4],也嚴重威脅著人類的身體健康。

水楊酸(SA)作為一種酚類物質(zhì)廣泛存在于各種植物中,其在植物的種子萌發(fā)、呼吸、氣孔關閉、開花和衰老等方面起著非常重要的作用[5- 6]。此外,SA也參與植物對生物和非生物脅迫的耐受性調(diào)節(jié)機制,如重金屬脅迫[6- 8]。近年來,SA對植物Cd脅迫耐受性的調(diào)節(jié)機制成為研究者關注的熱點,眾多的研究者在對水稻、大麥、蓖麻、豌豆、小麥、亞麻、大豆和花生等多種植物研究時發(fā)現(xiàn)SA可以增強植物對Cd脅迫的耐受性[9- 16]。這種耐受性調(diào)節(jié)機制主要包括以下幾個方面：穩(wěn)定細胞膜的完整性[12- 14]、維持離子平衡[10,14]、影響其他激素的含量[13]、改變Cd的攝取和分配[15-16]、增強抗氧化防衛(wèi)系統(tǒng)[9,12]、增強光合作用[11,13]以及調(diào)節(jié)其他的信號通路[9]等。一氧化氮(NO)是普遍存在于動植物中的一種活性分子,它可以作為抗氧化劑,直接清除因脅迫引起的活性氧(ROS)積累;在抵抗重金屬脅迫時,NO可以增加植物細胞壁果膠和半纖維素的含量,從而增強植物對Cd的耐受性[17],但是NO的這種保護效應主要還是依賴于植物種類、作用劑量和作用時間等[18-19]。此外,NO可以和多種激素形成交叉作用從而調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。已有研究發(fā)現(xiàn)NO可以和乙烯(ETH)信號交互作用,調(diào)節(jié)植物抗病性、細胞死亡以及包括鹽、重金屬在內(nèi)的非生物脅迫的耐受性[20]。如Mur等[21]研究發(fā)現(xiàn),煙草發(fā)生由細菌病原體引起的超敏反應時會迅速產(chǎn)生NO,在NO產(chǎn)生6 h后ETH產(chǎn)生,這可能是在高NO濃度下ETH合成基因被啟動,而后NO和ETH相互作用,起到抵御疾病,調(diào)節(jié)細胞死亡的作用;劉菁等[22]實驗觀察到ETH可以誘導擬南芥保衛(wèi)細胞 NO水平升高,而清除NO則會減弱這種誘導效應;有研究者發(fā)現(xiàn),鹽脅迫初期擬南芥愈傷組織中NO和ETH會迅速增加,并且ETH的產(chǎn)生依賴于NO,二者相互作用調(diào)控離子平衡,以此來提高植物對鹽脅迫的耐受性[23];袁滿等[24]以荷花為實驗材料,研究發(fā)現(xiàn)外源添加SNP和ETH信號轉(zhuǎn)導抑制劑可以顯著緩解Cd脅迫處理下荷花葉片的毒害癥狀。另有研究報道,植物在重金屬與鹽的耐受性調(diào)節(jié)、衰老、細胞程序性死亡、氣孔關閉和丹酚酸B的積累等方面與NO和SA的交互作用有關聯(lián)[25- 30]。如SA和NO可顯著降低鋅對紅花的毒性、減緩鹽脅迫對番茄幼苗的損傷等[25- 26];此外,外源SA可誘導植物大量產(chǎn)生NO,從而延緩葉片的衰老,調(diào)節(jié)氣孔關閉,而若將NO清除,效應則會消失[27,29]等。諸多研究者以不同植物為實驗材料研究表明,SA可以誘導NO的產(chǎn)生,NO也可以影響SA的積累[31-32]。然而在以小麥為材料的研究中,SA和NO對Cd脅迫的耐受性調(diào)節(jié)機制仍不清楚。

小麥是全球最重要的糧食作物之一,供養(yǎng)著全世界大約三分之一的人口,但是近年來由于人為及自然等因素,全球重金屬污染土壤面積不斷擴大,尤以鎘污染為重[1]。過量的鎘不僅嚴重影響小麥等植物的生長發(fā)育,且通過食物鏈進入人體,嚴重危害人類的健康,所以如何減少小麥對Cd的吸收,增強小麥的耐Cd能力,一直是研究者關注的熱點。本研究以“隴春27”號小麥幼苗為研究材料,探討SA和NO互作在小麥對Cd脅迫響應過程中的調(diào)節(jié)作用,為小麥早期抗Cd脅迫的調(diào)節(jié)機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)

“隴春27”號小麥購自甘肅省農(nóng)業(yè)科學院,種子用0.1%的氯化汞消毒10 min,流水沖洗10 h,黑暗中萌發(fā)24 h,挑選均一飽滿、發(fā)芽基本一致的種子于小燒杯中(培養(yǎng)條件為12 h/12 h(光照/黑暗)、溫度(25±2)℃及光照強度300 μmol m-2s-1),用1/4 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)3 d后：(1)100 μmol/L的氯化鎘(CdCl2)分別處理0 h、6 h、12 h、24 h和48 h;(2)0、50、100、200、400 μmol/L和800 μmol/L的SA或SNP預處理小麥幼苗6 h后,用100 μmol/L的CdCl2脅迫處理24 h;(3)分別用SA(400 μmol/L)、c-PTIO(100 μmol/L)、L-NAME(100 μmol/L)、Tungstate(100 μmol/L)單獨處理小麥幼苗6 h,再培養(yǎng)24 h;用CdCl2(100 μmol/L)脅迫處理小麥幼苗24 h;分別用SA(400 μmol/L)、SA(400 μmol/L)+c-PTIO(100 μmol/L)、SA(400 μmol/L)+L-NAME(100 μmol/L)、SA(400 μmol/L)+Tungstate(100 μmol/L)預處理小麥幼苗6 h,再用CdCl2(100 μmol/L)脅迫處理24 h,取小麥根測定相關指標,剩余根剪下于液氮中迅速冷凍,放置于-80℃下保存用于后續(xù)實驗。對照組均用1/4 Hoagland營養(yǎng)液處理,每個實驗至少重復3次。

1.2 測定方法

1.2.1SA含量的測定

SA含量的測定參考馬莉等[33]的方法,采用反相高效液相色譜法(HPLC);以AT. Lichrom ODS(4.6 mm×250 mm,5 m)為色譜柱,流動相乙腈-1%醋酸水溶液(25:75),檢測波長225 nm,流速1.0 mL/min,柱溫為室溫。

1.2.2NO含量的測定

參照Orozco-Ca′rdenas[34]和Murphy[35]等的方法測定NO的含量。將0.5 g小麥幼苗根在100 U過氧化氫酶(CAT)和100 U的超氧化物歧化酶(SOD)中孵化5 min,除去內(nèi)源ROS,然后加入5 mL 10 μmol/L的氧合血紅蛋白,37℃孵育5 min后,使用分光光度法測定在401 nm處和421 nm處提取物中氧合血紅蛋白轉(zhuǎn)化成甲基血紅蛋白的量來計算NO的含量。

1.2.3根長和葉綠素含量的測定

不同處理培養(yǎng)小麥后,用直尺測量小麥幼苗根長;葉綠素的測定參照Lichtenthaler等[36]的方法,取0.5 g小麥幼苗葉片,加入適量的95%乙醇研磨,離心后收集上清液,向沉淀中再次加入95%乙醇進行洗滌離心,收集上清液,合并兩次收集的上清液,定容至25 mL,測定其在470 nm,663 nm,646 nm處的吸光值,并計算其含量。

1.2.4NR活性的測定

按照Tian等[37]的方法測定NR的活性。取0.2 g小麥幼苗根加入2 mL提取緩沖液(50 mmol/L Hepes-KOH(pH 7.5),5%甘油,10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)、1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)、1 mmol/L苯甲脒和10 μmol/L腺嘌呤黃素(FAD)),研磨成勻漿,4℃,15000 g離心20 min。250 μL上清液中加入250 μL的反應緩沖液(50 mmol/L Hepes-KOH(pH 7.5)、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L DTT、2 mmol/L KNO3、10 μmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸),30℃下反應5 min后,用50 μL 0.5 mol/L乙酸鋅、150 μL 1%磺胺和150 μL 0.02% N-(1-萘基)乙二胺鹽酸鹽混合液終止反應,然后15000 g離心2 min,取上清液在540 nm處其吸光值,計算NR的活性。

1.2.5NOS活性的測定

按照Murphy等[35]的方法測定NOS的活性,略有改動。1 g小麥幼苗根在2 mL提取緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)、1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、320 mmol/L蔗糖、1 mmol/L DTT,1 μmol/L亮抑蛋白、1 μmol/L胃抑蛋白和1 mmol/L PMSF,0.1%聚乙烯吡咯烷酮)中研磨成勻漿,然后4℃、10000 g離心30 min,取適量上清液加入5 mL 100 U的CAT和100 U的SOD,孵化5 min,然后加入5 mL 10 μmol/L氧合血紅蛋白,在37℃下孵育30 min后,使用分光光度法測定在401 nm處和421 nm處測定其吸光值并計算NOS活性。

1.3 統(tǒng)計學分析

每個數(shù)據(jù)平行3次實驗,用SPSS Statistics 23.0、Origin 2018和 Adobe Photoshop CC 2018對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析及整理作圖,P<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫對小麥幼苗根中內(nèi)源SA和NO含量的影響

由圖1可以看出,小麥幼苗根中SA含量的變化趨勢是隨著Cd處理時間的延長逐漸下降,與對照相比,處理6 h和12 h時SA含量分別降低了15.8%和39.8%,處理時間為24 h和48 h時,分別降低了65%和63.8%,可以看出SA的含量在這兩個時間點之間并無顯著差異,而由圖1可以看到,小麥幼苗根中內(nèi)源NO含量隨著時間的延長呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢,與對照相比,100 μmol/L的CdCl2處理后,小麥幼苗根中內(nèi)源NO的含量在6 h時達到最大,是對照的1.5倍,處理24 h和48 h后,其根中內(nèi)源NO含量明顯低于對照,分別降低為對照的83%和62%。

圖1 100 μmol/L的CdCl2處理小麥幼苗不同時間后其根中SA和NO含量的變化Fig.1 The changes of SA and NO content in roots of wheat seedlings treated with 100 μmol/L CdCl2 for different timeSA: 水楊酸 Salicylic Acid; NO: 一氧化氮 Nitric Oxide;圖中各小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)

2.2 SA和NO對Cd脅迫下小麥幼苗的緩解作用

由圖2可以看出,Cd脅迫下,外源添加不同濃度的SA和SNP預處理小麥幼苗,隨著SA或SNP濃度的增加,小麥幼苗根長和葉綠素含量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,其中添加400 μmol/L SA和200 μmol/L SNP預處理對Cd抑制的緩解效果最好,小麥幼苗根長和葉綠素含量基本恢復正常水平,用400 μmol/L SA預處理后其葉綠素含量甚至略微高于對照,之后隨著SA或SNP濃度的升高,根長和葉綠素含量均顯著降低。

圖2 不同濃度SA和SNP預處理的小麥在100 μmol/L CdCl2脅迫下其幼苗根長和葉綠素含量變化Fig.2 The changes of root length and chlorophyll content of wheat seedlings under 100 μmol/L CdCl2 stress after being pretreated with different concentrations of SA and SNPCd: 100 μmol/L氯化鎘 Cadmium chloride; SNP: 硝普鈉 Sodium Nitroprusside;圖中各小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)

2.3 不同處理對小麥幼苗根長及葉綠素和內(nèi)源NO含量的影響

如表1所示,與對照相比,單獨的c-PTIO、L-NAME、Tungstate預處理顯著降低了小麥幼苗的根長,而對其葉綠素含量影響不大。此外,單獨400 μmol/L SA預處理使小麥幼苗內(nèi)源NO含量顯著升高,而單獨c-PTIO、L-NAME、Tungstate預處理的效果與其相反,呈現(xiàn)顯著降低的趨勢。在Cd脅迫下,外源添加400 μmol/L SA預處理小麥幼苗使根的長度,葉綠素和內(nèi)源NO的含量得到顯著增加,但是外源SA的誘導效應被c-PTIO和Tungstate所抑制,而添加L-NAME對外源SA的誘導效應幾乎沒有影響。另外,與單獨的400 μmol/L SA預處理相比,400 μmol/L SA預處理使Cd脅迫下小麥幼苗表現(xiàn)出更好的根系長勢,但是SA對Cd脅迫下小麥幼苗根長的保護效應在添加c-PTIO和Tungstate預處理后被逆轉(zhuǎn)。

表1 不同處理下小麥幼苗根長(cm)及葉綠素(mg/g Fw)和內(nèi)源NO含量(μmol/g Fw)的變化

2.4 SA對Cd脅迫下NR和NOS活性的影響

從圖3可以看出,與對照相比,單獨外源400 μmol/L SA預處理使得小麥幼苗根中NR的活性顯著升高為對照的2.4倍,而單獨Cd處理顯著抑制了NR的活性,使其降低為對照的81%,添加外源SA預處理后這種抑制作用被解除,相比之下,不同處理下NOS的活性(圖3)不受影響。

圖3 SA預處理的小麥幼苗在Cd脅迫下其根中NR和NOS活性的變化Fig.3 The changes of NR and NOS activities in the roots of wheat seedlings under Cd stress after being pretreated with SANR：硝酸還原酶 Nitrate Reductase; NOS：一氧化氮合成酶 Nitric Oxide Synthase;圖中各小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)

3 討論

3.1 Cd脅迫下小麥幼苗根中SA和NO含量的變化

SA廣泛存在于植物體內(nèi),不僅在植物的生長發(fā)育中起著重要的作用,而且能夠通過調(diào)節(jié)各項生理活動,從而降低逆境脅迫對植物的傷害[5- 6]。在重金屬脅迫下,SA可以通過螯合重金屬從而降低重金屬引起的毒性并使ROS分解,因此從而提高植物對重金屬脅迫的耐受性[38]。鄭慧芳[39]研究發(fā)現(xiàn),Cd脅迫導致楊樹莖中SA含量顯著降低,這與本研究的結(jié)果相似。本研究中,隨Cd脅迫處理時間的延長,小麥幼苗根中SA含量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(圖1),可能是因為其與Cd螯合,減少了Cd脅迫引起的毒性,并使ROS分解,從而導致SA含量降低。

NO是調(diào)節(jié)植物生長和發(fā)育的關鍵氣體信號分子,能夠在多種脅迫環(huán)境下維持植物正常的生理生化活動,從而增強植物對脅迫環(huán)境的耐受能力[37,40]。研究發(fā)現(xiàn),鋁(Al)誘導了小麥Al耐受性品種Jian- 864中NO含量早期的爆發(fā),這種爆發(fā)發(fā)生在3 h,隨后在6 h下降,12 h和24 h時又開始上升,且其含量全部高于對照,進一步深入研究發(fā)現(xiàn)這種早期NO含量的劇增對于小麥耐受Al脅迫具有非常重要的意義,但是在對Al敏感的小麥品種中并未發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象[41]。胡炎[42]的研究中也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象,發(fā)現(xiàn)東南景天超積累生態(tài)型和非超積累生態(tài)型根系NO含量分別在鎘處理24 h和36 h時達到最大,隨后隨著時間的加長逐漸降低,這種短期的鎘脅迫誘導植物根系NO的積累可能與其對鎘的耐受性有關。本實驗通過測定小麥幼苗在不同時間Cd處理后內(nèi)源NO的含量發(fā)現(xiàn),NO含量在6 h時相比對照極顯著地升高了,隨后持續(xù)下降(圖1)。因此,本研究中6 h時NO含量的升高可能對小麥抵抗Cd脅迫起著非常重要的作用。

3.2 外源SA或SNP預處理對Cd脅迫下小麥幼苗根長及葉綠素含量的影響

大量的研究表明,當脅迫環(huán)境誘導特定物質(zhì)(抗氧化分子、激素、信號分子等)減少時,通過外源添加緩解物質(zhì)或補償特定的供體能部分或完全恢復植物的耐受性。一定濃度的外源SA預處理可以減輕Cd脅迫對番茄生長的毒害作用,促進其根莖的生長[43];此外,外源SA也顯著促進了Cd脅迫下甜瓜幼苗的生長,提高了葉片葉綠素的含量[44]。相似,本實驗中外源添加一定濃度的SA顯著促進了小麥幼苗根的生長,并使葉片葉綠素含量顯著增加(圖2),其中以400 μmol/L SA預處理效果最好,可見外源添加SA能降低小麥幼苗因Cd脅迫造成的傷害,說明Cd脅迫下SA對小麥幼苗具有直接的保護作用,但是這種保護作用與其含量息息相關。

諸多研究報道,當植物遭遇脅迫環(huán)境時,外源添加緩解物質(zhì)可有效促進植物的生長發(fā)育。敬巖等[45]研究報道,缺鐵脅迫下,外源加入NO誘導劑能顯著促進玉米葉片中葉綠體的發(fā)育,并提高光合鏈的電子傳遞速率, 從而顯著地增加了葉片的光合活性;此外,適宜濃度的SNP可以顯著緩解Cd脅迫導致的苧麻根長減短和葉綠素含量降低的狀況,但是若SNP濃度過高則緩解作用不顯著[18]。本實驗也得到相似的結(jié)果,使用一定濃度的SNP預處理小麥幼苗,Cd脅迫下其根長及葉綠素含量顯著升高(圖2),其中以200 μmol/L SNP預處理效果最好,過高濃度則緩解效果不明顯,說明一定濃度的外源SNP能夠緩解Cd脅迫對植物生長的抑制作用。

3.3 Cd脅迫下SA與NO互作的效應

眾多研究發(fā)現(xiàn),SA和NO交互作用參與了植物許多的生理過程。例如Ji等[27]研究報道,外源SA可誘導擬南芥葉片中NO大量產(chǎn)生,從而延緩葉片衰老,而清除NO則會使這種延緩效果減弱,SA也能夠和NO相互作用從而調(diào)節(jié)蠶豆氣孔的關閉[29]。此外,在根形態(tài)的發(fā)生、次生代謝物的產(chǎn)生以及非生物脅迫等方面SA和NO也有著緊密的聯(lián)系[46- 49],那么二者在Cd脅迫下是否也存在著相互作用。本研究發(fā)現(xiàn),外源添加SA預處理可顯著緩解由Cd脅迫造成的小麥幼苗根長減短及葉綠素含量降低的狀況,而這種緩解作用卻被c-PTIO或Tungstate所逆轉(zhuǎn),且小麥幼苗根中NO含量的變化也與此相似(表1)。這些結(jié)果說明：在Cd脅迫下,SA和NO存在著一定的相互作用,且SA對Cd脅迫下小麥幼苗的這種保護作用可能是因為影響了NO的合成。

植物中NO的合成包括酶促與非酶促途徑,NR和NOS是兩種潛在的酶促來源。NO的合成具體由哪個酶催化,受環(huán)境條件、生長時間、植物種類、外源物質(zhì)等因素的影響[50-52]。小麥對Al脅迫響應中的NO是由NR介導產(chǎn)生的[41],而干旱誘導三葉草NO的合成過程中,NOS可能發(fā)揮著更重要的作用[51]。砷脅迫下,外源添加SA提高了水稻根中NR的活性[48],表明NR參與了SA誘導的水稻根中NO的合成。本研究也得到相似的實驗結(jié)果,外源添加SA預處理小麥使其幼苗根中NR活性顯著升高,而NOS活性不受影響(圖3),表明外源SA誘導了Cd脅迫下小麥幼苗根中NO的產(chǎn)生,且NO的合成依賴于NR途徑,這種依賴性可以進一步被Tungstate處理下NO含量產(chǎn)生的變化所確定(表1)。

4 結(jié)論

Cd脅迫導致小麥幼苗根內(nèi)源SA含量降低,而NO含量先升高后降低;外源SA或SNP預處理可以減緩Cd脅迫對小麥幼苗根生長的抑制作用,增加葉綠素的含量;外源SA通過影響NO的產(chǎn)生從而提高小麥幼苗對Cd脅迫的耐受性,最終緩解了Cd對小麥幼苗的植物毒作用。