■杜 涓 安曉萍 劉 娜 王 園 何香凝 齊景偉

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古自治區(qū)草食家畜飼料工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

玉米作為我國主要的飼料作物，長期以來被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)，玉米芯是玉米棒脫粒后剩余部分。我國玉米年產(chǎn)量超過2 億噸，其中玉米芯產(chǎn)量約占10%，最終產(chǎn)量超2 000萬噸[1-2]。研究表明，玉米芯中主要含有32%～36%的纖維素、35%～40%的半纖維素、17%～20%的木質(zhì)素以及少量的灰分等成分[3]，作為飼料直接飼喂，不僅適口性差，而且粗纖維含量較高，動物的消化吸收率低，在生產(chǎn)中很少使用。因此，提高對玉米芯的深度開發(fā)利用具有重要意義。

多糖是一類由多個單糖分子縮合、失水而成，結(jié)構(gòu)龐大且復雜的糖類物質(zhì)，廣泛存在于大自然中[4-6]。大部分多糖均具有一定的生物活性。研究證實，玉米芯多糖作為一種高附加值產(chǎn)品具有抗氧化、抗凝血和抗菌等生物活性作用[7-9]，其巨大的研究和開發(fā)價值引起了研究學者的廣泛關(guān)注。玉米芯多糖的提取方法大致可分為物理法[10]、化學法[11-12]和生物法[13-14]三大類。物理法和化學法雖然有效但對工藝要求嚴格，如果超出工藝要求的范圍可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂，對多糖的組成和活性有較大的影響。生物法中的酶法提取是一項近幾年來作為天然植物分離提取的熱門生物技術(shù)，相對于其他提取方法，具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物不易變性、提取效率高、方便簡易等顯著的優(yōu)勢[15-16]。酶可使玉米芯中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素之間的化學鍵破壞，使活性成分充分地釋放[17]。酶法提取的玉米芯多糖的抗氧化能力需要評價，因此本試驗通過酶解提取玉米芯多糖，分析其結(jié)構(gòu)特性，以半抑制濃度（IC50）為參考依據(jù)，對比與原料玉米芯多糖的體外抗氧化能力的差異情況，為玉米芯的高附加值開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米芯、玉米、豆粕和麩皮均購于市場。纖維素酶購自夏盛（北京）生物科技開發(fā)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶解玉米芯的制備

將原料按照一定的配比稱量（65%玉米芯粉+20%玉米粉+10%豆粕粉+5%麩皮），混勻得到原料玉米芯，再加入纖維素酶1 000 U/g，混勻后加入35%的水充分攪拌，pH 為5.0，放入55 ℃培養(yǎng)箱中酶解20 h后得到酶解玉米芯。

1.2.2 玉米芯多糖粗提物的制備

將酶解玉米芯45 ℃烘干后粉碎，取2 g原料和酶解玉米芯分別加入20 mL純化水，80 ℃水浴30 min后離心（5 000 r/min，10 min），取上清液，冷凍干燥得到原料和酶解玉米芯水提物。

采用Sevage法去蛋白，將上步得到的原料和酶解玉米芯水提物使用純化水復溶成40%的溶液，離心得到上清液，分別與Sevage 試劑（三氯甲烷∶正丁醇=4∶1）3∶1混合，磁力攪拌器振蕩30 min后離心收集上清液，再加入Sevage 試劑按比例混合，重復3 次后收集最后一步的上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后凍干，加入4 倍體積的乙醇，醇沉12 h，將沉淀再次凍干，即得到原料和酶解玉米芯粗多糖。

1.3 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[18]。將原料玉米芯和酶解玉米芯水提物的上清液稀釋60 倍，取0.5 mL 樣品稀釋液補水至1 mL，加入0.5 mL 5%苯酚和2.5 mL 濃硫酸，20 min后于490 nm下測吸光度。

1.4 結(jié)構(gòu)分析

1.4.1 紅外光譜

將1～2 mg的原料玉米芯和酶解玉米芯多糖分別和100 mg的溴化鉀混勻，在研缽內(nèi)研磨，取少許放在模具中壓片，于400～4 000 cm-1區(qū)間進行紅外光譜掃描。

1.4.2 掃描電鏡

取適量的原料玉米芯和酶解玉米芯多糖樣品粘在樣品座上，用洗耳球吹去浮樣，使用掃描電鏡觀察其表觀形貌。

1.5 體外抗氧化能力的測定

1.5.1 DPPH自由基清除率的測定

試驗方法參照Zhongshan 等[19]。將原料、酶解玉米芯多糖及對照丁基羥基茴香醚（BHA）分別配制成0.5、1、2 mg/mL 和4 mg/mL 濃度的樣品溶液。各取2 mL，依次加入2 mL DPPH試劑，混勻后于室溫下反應(yīng)30 min。在517 nm處測其吸光度，即為A0。95%乙醇代替DPPH測得的吸光度即為A1，純化水代替樣品測得的吸光度即為A2，根據(jù)清除率計算得半抑制濃度。

計算公式：DPPH清除率（%）=[1-（A0-A1）/A2]×100

1.5.2 羥基自由基的清除能力

試驗方法參照Singh等[20]。將原料、酶解玉米芯多糖及對照BHA分別配制成0.5、1、2 mg/mL和4 mg/mL濃度的樣品溶液。取樣品溶液0.5 mL 加入0.5 mL 9 mmol/L的硫酸亞鐵溶液，0.5 mL 8.8 mmol/L的過氧化氫溶液，室溫反應(yīng)10 min。加入0.5 mL 的9 mol/L的水楊酸乙醇溶液，在室溫條件下反應(yīng)30 min，于510 nm處測其吸光度，OD值即為A1，純化水代替樣品的吸光度即為A0。純化水代替硫酸亞鐵溶液的吸光度即為A2，根據(jù)清除率計算得半抑制濃度（IC50）。

羥基自由基清除能力（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100

1.5.3 還原力

試驗方法參照參考黃忠等[21]。取樣品溶液0.75 mL加入0.75 mL磷酸緩沖液，0.75 mL六氰合鐵酸鉀溶液，50 ℃反應(yīng)20 min。加入10%的三氯乙酸溶液0.75 mL。取1.5 mL 最終上清液，加入1.5 mL 蒸餾水和400 μL 0.1%氯化鐵溶液，室溫反應(yīng)10 min。在700 nm 處測其吸光度。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗所有數(shù)據(jù)均采用SAS 9.2 進行單因素方差分析；采用SPSS 21.0 進行IC50值分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解玉米芯多糖含量（見圖1）

由圖1可見，酶解玉米芯多糖含量顯著高于未酶解的原料玉米芯多糖含量（P＜0.05），原料玉米芯多糖含量為75.45 mg/g，酶解玉米芯多糖含量為245 mg/g，玉米芯酶解后其多糖含量提高了224.7%。

圖1 酶解玉米芯多糖含量

2.2 玉米芯多糖的紅外光譜分析結(jié)果

原料和酶解玉米芯多糖在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)的紅外吸收光譜圖見圖2。圖2可見，在兩種多糖的紅外光譜中，波長范圍3 600～3 200 cm-1處出現(xiàn)一寬峰，這是O—H 和分子內(nèi)或分子間氫鍵的伸縮振動吸收峰[22]，2 900～3 000 cm-1處有吸收峰，表明有糖類—CH2或—CH3的C—H伸縮振動和彎曲振動[23]；1 617.32 cm-1處強的吸收峰是糖苷部分C＝O 伸縮振動吸收峰[24]。在1 400 cm-1左右較尖的吸收峰是C-H 變角振動吸收[25]；在1 250～950 cm-1之間是吡喃糖環(huán)的醚鍵和羥基的吸收峰，表明糖鏈存在吡喃糖構(gòu)型[26]。以上這些是糖類物質(zhì)的特征吸收峰，從而確定這兩種物質(zhì)均是多糖。

圖2 酶解和原料玉米芯多糖紅外光譜圖

2.3 玉米芯多糖的掃描電鏡結(jié)果（見圖3）

由圖3 可見，圖A 表示為原料玉米芯多糖，A1 和A2 為500×和1 000×下原料玉米芯多糖，可以看到表面光滑、孔洞松散、孔徑小、質(zhì)地堅硬。圖B表示為酶解玉米芯多糖，由圖B1（500×）和B2（1 000×）可以看出，在不同放大倍數(shù)下，酶解后的玉米芯多糖樣品的表面粗糙，立體結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)疏松、裂縫和較大程度的斷裂現(xiàn)象，表面積增大。

圖3 電子顯微鏡掃描結(jié)果

2.4 DPPH自由基清除率（見圖4）

圖4 酶解和原料玉米芯多糖DPPH自由基清除能力

從圖4可知，酶解玉米芯多糖濃度范圍0～4 mg/mL，隨著濃度增加，對DPPH 自由基清除能力均快速上升，呈劑量依賴式增長，在濃度4 mg/mL 時，對DPPH自由基清除率為91.5%，與對照BHA相比差異不顯著（P＞0.05）。原料玉米芯多糖對DPPH自由基清除能力也持續(xù)上升，但顯著低于酶解玉米芯多糖（P＜0.05）。酶解玉米芯多糖對DPPH 自由基清除能力的IC50為0.694 mg/mL，原料玉米芯多糖對DPPH自由基清除能力的IC50為1.330 mg/mL。

2.5 羥基自由基清除率（見圖5）

圖5 酶解和原料玉米芯多糖羥基自由基清除能力

從圖5 可知，酶解和原料玉米芯多糖對羥基自由基清除率范圍0～4 mg/mL，隨著濃度增加，呈上升趨勢，并顯示出一定的量效關(guān)系。在2～4 mg/mL 時，原料玉米芯與酶解玉米芯多糖對羥基自由基清除率顯著高于對照BHA（P＜0.05）；酶解玉米芯多糖對羥基自由基清除能力的IC50為0.982 mg/mL，原料玉米芯多糖對羥基自由基清除能力的IC50為1.071 mg/mL。

2.6 還原力（見圖6）

圖6 酶解和原料玉米芯多糖還原力

由圖6 可見，隨著樣品濃度的增加，還原力逐漸增強，最后趨于穩(wěn)定，當濃度達到4 mg/mL時，酶解玉米芯多糖的吸光度值為0.946，原料玉米芯多糖的吸光度值為0.899，但顯著低于陽性對照BHA（P＜0.05）。

3 討論

本試驗中，通過纖維素酶酶解玉米芯，使得玉米芯多糖含量得到了大幅的提高，這是由于纖維素酶降解了植物細胞壁和細胞膜，減少提取時來自細胞壁、細胞膜和細胞間質(zhì)的阻力，使有效成分得到釋放[27]，同時酶的使用也可將部分多糖由大分子降解為小分子物質(zhì)，從而更有利于多糖從細胞內(nèi)分離出來[28]。與本研究結(jié)果相似，段宙位等[29]和鄧桂蘭[30]的研究表明，酶法提取可提高多糖的提取率，增強抗氧化能力且效果優(yōu)于其他方法。皮雙雙等[31]研究發(fā)現(xiàn)，使用酶法提取黑糯玉米芯中的可溶性膳食纖維得率可達4.36%，具有良好的體外抗氧化活性。

紅外吸收光譜是鑒定生物大分子結(jié)構(gòu)最常用的方法，在紅外線照射下分子中的不同化學鍵吸收的頻率不同，由此來確定化學鍵或官能團種類的信息[32]。結(jié)果表明酶解和原料玉米芯多糖的紅外圖譜比較相似，均出現(xiàn)了多糖的特征吸收峰。此外，從圖2 發(fā)現(xiàn)原料玉米芯多糖在1 165 cm-1（酯鍵反對稱的C—O拉伸振動）處存在一個小的吸收肩峰，而在酶解玉米芯多糖中此峰幾乎消失。此現(xiàn)象表明在原料玉米芯多糖中仍保留部分酯鍵，而玉米芯在酶解后，木質(zhì)素酯鍵斷裂。總而言之，紅外圖譜表明，玉米芯經(jīng)過酶解后可以破壞木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)，釋放出更多的多糖，多糖含量結(jié)果也證實了這一現(xiàn)象。

玉米芯的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復雜，木質(zhì)素作為一個堅固的屏障，緊密包圍起纖維素和半纖維素[33]。因此，去除纖維屏障是提高玉米芯中多糖含量的有效方法。掃描電鏡結(jié)果顯示，原料玉米芯多糖表面較光滑平整，結(jié)構(gòu)較完整，表面有空洞可能是在提取和純化玉米芯多糖過程造成的影響，酶解后玉米芯多糖的立體結(jié)構(gòu)遭到破壞，表面產(chǎn)生很多空隙，平整的表面消失、斷裂，甚至變成碎小顆粒?？赡苊附饧夹g(shù)可造成多糖聚集體的破壞，將聚集體分成鏈條狀或小顆粒的碎片等[33]，從而使多糖得到了充分釋放，抗氧化能力增強。這些結(jié)果與何香凝等[33]研究微生物發(fā)酵對玉米芯木聚糖的表觀結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果相似。

目前，測定樣品對自由基的清除能力和還原力是使用最廣泛的評價抗氧化活性的方法[35]，Melo-Silvei?ra 等[36]發(fā)現(xiàn)使用甲醇提取的玉米芯提取物不具有清除羥基自由基的能力，但在總抗氧化能力和清除DPPH 能力測試中表現(xiàn)出較強的抗氧化活性，與抗壞血酸相比，其具有更高的還原能力和較強的超氧化物清除能力[37]。本試驗中應(yīng)用酶法酶解玉米芯，通過粗提取得到酶解玉米芯多糖，并以相同提取方法獲得原料玉米芯多糖與之對比，結(jié)果顯示，酶解和原料玉米芯多糖均具有較好的DPPH自由基清除能力，并隨著樣品濃度的升高快速增強，最終各組樣品對DPPH自由基的清除能力均接近于BHA；并且在羥基自由基清除能力結(jié)果中當樣品濃度為2～4 mg/mL 時，酶解和原料玉米芯多糖的抗氧化能力均高于BHA，酶解玉米芯多糖對DPPH 自由基和羥基自由基的清除能力均高于BHA。還原能力是指化學反應(yīng)中Fe3+還原成Fe2+失去電子的能力，失去電子的能力越強，還原性就越強，測得吸光度就越高[36]，研究結(jié)果顯示酶解后玉米芯多糖的還原力較未經(jīng)酶解玉米芯多糖的效果好，這說明酶解玉米芯多糖對鐵原子有很大的供電子能力，在此條件下提取物可作為抗氧化劑。

4 結(jié)論

使用纖維素酶酶解后的玉米芯通過提取得到的多糖較未酶解的玉米芯多糖含量更高，為245 mg/g，紅外圖譜分析發(fā)現(xiàn)酶解和原料玉米芯多糖均出現(xiàn)了多糖的特征吸收峰，且糖鏈為吡喃糖構(gòu)型，掃描電鏡結(jié)果表明酶解后玉米芯多糖的結(jié)構(gòu)受到破壞，表面斷裂，變成顆粒狀，較原料變化較大，酶解后的玉米芯多糖具有更強的DPPH自由基、羥基自由基和還原力，IC50值分別為0.694 mg/mL和0.982 mg/mL。這從某種意義上說明使用纖維素酶酶解玉米芯可以破壞其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，多糖得到了充分釋放，從而增強了抗氧化能力。