杜金娥，董志岷，王 貴，劉 暢

（河套學院農(nóng)學系，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000）

無殼孵化是一項新穎且備受關注的人工孵化技術，是人工孵化領域的又一次突破。無殼孵化對于推動孵化科技及生命科學的進一步發(fā)展具有里程碑式的意義。雞胚發(fā)育過程清楚，尤其在雞胚發(fā)育早期絨毛尿囊膜階段，因其血管豐富，是天然的免疫缺陷宿主，常作為病理學、藥理學和腫瘤學等研究領域的理想實驗模型。有資料顯示，研究人員采取代用蛋殼孵化、窄窗口蛋殼整胚胎培養(yǎng)及人造容器培養(yǎng)的孵化率均較低，且使用代用蛋殼的培養(yǎng)方法有很多弊端，如不同批次代用蛋殼有差異，無法循環(huán)利用，胚胎操作過程中可操作性低等［1-2］。為了建立一種無殼孵化成功率較高的簡單培育方法，筆者使用方便的透明玻璃杯而不是代用蛋殼作為人工培養(yǎng)容器，在其中補充鈣和水，通入氧氣等，通過孵化期間剖視對照組種蛋的雞胚生長發(fā)育情況，并與試驗組同日齡無殼雞胚的生長發(fā)育情況作對比，及時調(diào)整試驗組孵化條件，以提高雞胚的無殼孵化率。

1 材料與方法

1.1 材料 種蛋：本試驗所用種蛋均為同一蛋雞舍所產(chǎn)的5 d 內(nèi)新鮮種蛋，品種為紅波羅紅羽肉雞，又名紅寶，蛋重在55～60 g之間。

其他試劑及材料：青霉素鉀（400萬單位∕支），硫酸鏈霉素（100 萬單位∕支），兩性霉素B、乳酸鈣，新潔爾滅；聚甲基戊烯薄膜，透明玻璃杯，暖立方孵化器。

1.2 試驗設計 本試驗分對照組和試驗組兩組，兩組均選用同一品種、重量接近、新鮮度一致的種蛋各20 枚，所用孵化器型號相同，孵化條件一致。對照組種蛋經(jīng)過消毒后直接放入孵化器孵化，試驗組種蛋經(jīng)過消毒后先預孵化55 h再去殼放入人工培養(yǎng)容器中于孵化器內(nèi)繼續(xù)孵化。

1.3 方法

1.3.1 無殼孵化時小環(huán)境的準備 將透明杯洗凈消毒，使用時用純化水沖洗，在透明杯下緣2 cm 的高度打孔，直徑為1.5～2 cm，孵化前期（第1～18 d）在洞口堵上棉絮作為過濾器，用一根直徑2 mm 的塑料管插入棉絮和洞之間的空隙提供氧氣，同時用于孵化至18 d以后注入氧氣使用，代替19 d雞胚啟用肺呼吸所需大量氧氣。然后在杯內(nèi)注入青霉素鉀＋硫酸鏈霉素＋兩性霉素B抑菌水備用（如圖1）。

圖1 無殼雞胚人造培養(yǎng)容器示意圖

1.3.2 聚甲基戊烯薄膜的準備 用5%新潔爾滅消毒且晾干的種蛋在聚甲基戊烯薄膜上撐出蛋形（如圖2），并固定于注入抑菌水的透明杯內(nèi)，用橡皮筋固定杯口，在有蛋形的聚甲基戊烯薄膜內(nèi)加入乳酸鈣和純化水。

圖2 處理聚甲基戊烯薄膜示意圖

1.3.3 種蛋去殼后的孵化 在預孵化了50～55 h的種蛋鈍端劃線，用消毒過的剪刀尖扎眼兒，沿劃線剪2 cm 長的孔隙，輕輕將蛋液打入已加入乳酸鈣和純化水的聚甲基戊烯薄膜內(nèi)。在聚甲基戊烯薄膜上方距離蛋液0.5 cm 處打8～10 個直徑約1 mm 的通風孔，代替蛋殼表面的氣孔，蓋上透明杯杯蓋（如圖3），放入孵化器開始孵化（如圖4）。

圖3 預孵化55 h的種蛋去殼效果圖

圖4 無殼雞胚放入孵化器入孵

1.3.4 雞胚死亡判定方法 雞胚心跳消失，血管顏色變暗，界限模糊，可判定雞胚死亡。

2 結(jié)果及分析

2.1 雞胚存活率情況 根據(jù)統(tǒng)計，對照組種蛋在第7～16 d 雞胚死亡率為5%，第17～18 d 死亡率又增加5個百分點；試驗組雞胚有兩個死亡高峰：第一個是在第7～10 d，死亡率為30%，第二個是集中在第16～18 d，死亡率在第一個死亡高峰的基礎上又增加50～70個百分點，直至第18 d時雞胚全部停止發(fā)育，存活數(shù)為0。

表1 不同胚齡的雞胚存活率

2.2 第3～7 d 出現(xiàn)死亡的原因分析 孵化至第3～7 d，對照組死亡率為5%，試驗組死亡率為0。此期正是胚胎生長迅速、形態(tài)變化顯著時期，各種胎膜相繼形成而功能尚未完善，對環(huán)境變化敏感，易導致胚胎夭折，是孵化過程中的第一個死亡高峰期。另外，種蛋貯存不當會降低胚胎活力，維生素A缺乏也會有重大影響。

2.3 第16～18 d 出現(xiàn)死亡的原因分析 第16～18 d，對照組死亡率為5%～10%，試驗組死亡率為75%～100%。此期是雞胚呼吸方式由尿囊呼吸轉(zhuǎn)向肺呼吸的關鍵時期，胚胎生理變化劇烈，需氧量劇增，自身產(chǎn)熱猛增，通風換氣不足而導致胚胎死亡，形成孵化過程中的第二個死亡高峰期。試驗組雞胚在此期沒有順利完成由尿囊呼吸向肺呼吸的轉(zhuǎn)變，吸入氧氣不足，故出現(xiàn)大量死亡。

3 提高無殼孵化率的因素分析

3.1 通風換氣 通風換氣是無殼孵化較難掌握的環(huán)節(jié)，氧氣、二氧化碳含量對孵化率都有明顯的影響，如氧氣含量在21%時孵化率最高，氧氣含量每升高1%，孵化率下降1%，氧氣含量每下降1%，孵化率下降5%。二氧化碳含量控制在0.5%以下對孵化率沒有明顯影響。因此，與蛋液直接接觸的聚甲基戊烯薄膜上氣孔直徑不能過大，數(shù)量不能過多，否則氧氣通入量過多，蛋液的蒸發(fā)速度高于雞胚對蛋液的吸收速度，蛋液變干而易導致雞胚死亡。

3.2 鈣的添加 對于雞胚來講，蛋殼具有保護雞胚防止外界細菌侵入蛋內(nèi)的作用，另外，蛋殼的主要成分為碳酸鈣，可以為雞胚發(fā)育提供所需的鈣質(zhì)。孵化至第11 d，雞胚開始從蛋殼中吸收鈣，第19 d 達到最高峰，因此雞胚中80%的鈣來源于蛋殼。為防止雞胚在發(fā)育過程中因缺鈣受到影響，或避免孵出的小雞出現(xiàn)畸形（如爪部彎曲，不能站立等），甚至出現(xiàn)存活率低下等問題，要在入孵前加入一定量的乳酸鈣來代替蛋殼中的鈣。

3.3 無菌操作 無殼孵化過程中由于雞胚脫離蛋殼，失去了蛋殼的保護，外界微生物極易侵入污染早期胚胎，因此去殼的過程需在超凈工作臺上進行。

3.4 轉(zhuǎn)蛋要求 轉(zhuǎn)蛋的目的是改變胚胎方位，防止胚胎粘連，使胚胎各部分均勻受熱，促進羊膜運動。本試驗使用的瑞科自動孵化器設定了轉(zhuǎn)蛋次數(shù)，孵化第1～18 d，每90 min轉(zhuǎn)蛋一次，轉(zhuǎn)蛋角度應與垂直線呈45°角。由于試驗組種蛋已去掉蛋殼，故轉(zhuǎn)蛋需人工操作，即在玻璃杯下方支一物體，使玻璃杯傾斜，且達到45°轉(zhuǎn)蛋角度，每隔90 min 反向轉(zhuǎn)至對側(cè)的同一位置。因雞胚失去蛋殼保護，故手動轉(zhuǎn)蛋時動作要輕，以防尿囊破裂造成雞胚發(fā)育中斷而死亡。

Assheton［3］、Perry［4］、Naito［5］、Ono［6］等人曾用不同人工培養(yǎng)容器培養(yǎng)雞胚，但是孵化率均較低。筆者使用透明聚甲基戊烯薄膜來孵化，不僅能從任何角度肉眼觀察胚胎的生長發(fā)育階段及其形態(tài)變化，而且只要拿走塑料蓋揭開薄膜就可以進行胚胎操作。目前，進一步提高無殼雞胚的孵化率是未來研究的重要方向，如果能獲得穩(wěn)定的孵化率，將對胚胎操作具有很大的幫助，不但可用于再生醫(yī)學的基礎研究，也可以用于組織培養(yǎng)，鳥類胚胎干細胞的研究以及作為生物反應器雞蛋的批量生產(chǎn)。