雷 永 王志慧 淮東欣 高華援 晏立英 李建國 李威濤 陳玉寧 康彥平 劉海龍 王 欣 薛曉夢 姜慧芳 廖伯壽,*

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物生物學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室, 湖北武漢 430062; 2 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花生研究所, 吉林公主嶺 136100

花生是我國重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物。近10年來,我國花生年均總產(chǎn)約1680萬噸, 居世界首位, 占全球花生總產(chǎn)的 38%[1]。我國花生總產(chǎn)約 50%用于榨油, 40%作為食用, 歐美等發(fā)達(dá)國家生產(chǎn)和進(jìn)口的花生則 70%以上作為食用和食品加工原料。隨著人民生活水平的提高和加工技術(shù)的進(jìn)步, 我國花生食用及食品加工量將越來越大, 對原料的需求越來越多樣化[2]。含糖量高低對于花生的食用品質(zhì)、加工風(fēng)味有重要影響, 含糖量和甜度高是鮮食花生的關(guān)鍵品質(zhì)指標(biāo)。研究表明, 花生籽仁含糖量可作為預(yù)測烤花生風(fēng)味和甜度的重要指標(biāo), 與花生籽仁口味品質(zhì)相關(guān)系數(shù)達(dá)0.88, 糖含量的微小變化也會影響最終的烘烤質(zhì)量[3-5]?；ㄉ勺讶手姓崽呛窟_(dá)到6%以上時(shí), 口感較好。成熟花生籽仁中的糖類主要是蔗糖,占90%左右。因此, 發(fā)掘和培育高蔗糖含量的種質(zhì)和品種, 對于食用型花生品質(zhì)的提升具有重要價(jià)值。

已有研究表明, 花生含糖量是可以遺傳的性狀[3-6],不同市場型花生的含糖量有顯著差異, 蘭娜型(runner type)、弗吉尼亞型(virginia type)、瓦倫西亞型(valencia type)的總糖量均值分別為2.90%、3.51%和2.88%, 西班牙型(spanish type)花生資源的蔗糖含量在2.44%～7.61%之間[7-8]。如何對資源材料和育種后代的蔗糖含量進(jìn)行高通量、規(guī)?；臋z測分析,是選育高糖優(yōu)異食用型花生品種的關(guān)鍵技術(shù)。目前,傳統(tǒng)的花生籽仁蔗糖含量測定方法多采用比色法和液相色譜法, 耗時(shí)、費(fèi)力且不能進(jìn)行高通量檢測。近紅外光譜法具有非破壞性、快速、高效的特點(diǎn), 在農(nóng)作物品質(zhì)分析中已得到廣泛應(yīng)用[9-11]。花生中已經(jīng)建立了含油量、脂肪酸、蛋白質(zhì)、氨基酸等重要品質(zhì)指標(biāo)的近紅外模型, 但在籽仁蔗糖檢測方面應(yīng)用的較少[12-19]。秦利等[20]和唐月異等[21]分別利用瑞典波通DA7200和德國布魯克 Matris-I近紅外光譜儀建立了多?；ㄉ讶实恼崽呛拷t外模型, 但建立模型與測試時(shí)需要的籽仁量較大(30～50粒), 不能對籽仁量較少的單株進(jìn)行蔗糖含量檢測, 并且以上 2種型號光譜儀采集的光譜無法在其他公司生產(chǎn)的光譜儀上應(yīng)用[20-21]。

為了深入探索近紅外光譜分析法的儀器廣適性,本研究通過對185份花生樣品蔗糖含量的測定, 利用Unity近紅外儀掃描樣品的光譜, 建立和優(yōu)化花生成熟籽仁蔗糖含量的近紅外分析模型, 以期為花生蔗糖含量測定提供更加快捷有效的方法, 加快食用型花生品種選育進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 研究材料

建模所用花生材料系本團(tuán)隊(duì)收集的國內(nèi)育成品種和培育的高含糖量中間材料, 總計(jì) 185份, 其中S001～S121是團(tuán)隊(duì)選育的蔗糖含量較高的育種中間材料, 種植地點(diǎn)為湖北武漢, S122～S185是篩選的含糖量有顯著差異的品種在多個(gè)地方種植的樣品(表1)。另取 20份樣品, 編號為 ST01～ST20, 作為外部樣品用于模型驗(yàn)證。

(續(xù)表 1)

1.2 研究方法

1.2.1 光譜采集 采用美國 Unity科技公司生產(chǎn)的 SpectraStar XL近紅外光譜儀采集光譜, 光譜儀掃描波長范圍為1100～2500 nm。調(diào)整環(huán)境溫度在20℃左右, 樣品在20℃左右恒溫放置48 h以上, 儀器開機(jī)預(yù)熱30 min后, 每個(gè)樣品取15～20粒籽仁, 裝入直徑為3 cm的小樣品杯, 重復(fù)裝樣3次, 獲得平均光譜用于建模(圖1)。

1.2.2 蔗糖含量測定 將采集光譜所用的花生籽仁用磨樣器磨碎, 稱取1 g粉末樣品(重復(fù)3次), 至50 mL的離心管中, 加入10 mL的80%乙醇溶液, 80℃水浴30 min; 冷卻至室溫, 取上清2 mL, 14,000×g離心5 min; 離心后取上清700 μL, 過濾至上樣瓶中待上機(jī)檢測。高效液相色譜型號為Agilent 1290, 示差折光檢測器(RID)檢測, 柱子型號20RBAX NH2 (4.6 mm × 250 mm, 5 μm), 流動相為 75∶25 (v/v)乙腈/水溶液, 流速1 mL min-1, 柱溫40℃, 進(jìn)樣量 10 μL。按照GB 5009.8-2016[22]中高效液相法的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法, 配制2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mg mL-1濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液, 過濾至上樣瓶進(jìn)行上機(jī)測定, 記錄不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積, 以峰面積對濃度進(jìn)行線性回歸, 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。試樣溶液上機(jī)檢測, 記錄目標(biāo)峰面積, 從標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得試樣溶液中蔗糖的濃度。

1.2.3 模型構(gòu)建與優(yōu)化 采用Unity科技公司自帶的UCAL近紅外定標(biāo)軟件構(gòu)建模型, 將測得的蔗糖含量化學(xué)值與采集的近紅外光譜導(dǎo)入U(xiǎn)CAL軟件進(jìn)行擬合光譜處理, 采用最小二乘法優(yōu)化建模, 建模過程中自動剔除較大剩余值的異常樣品, 然后再進(jìn)行內(nèi)部交叉驗(yàn)證剔除異常值, 通過比較模型的決定系數(shù)(R2)和標(biāo)準(zhǔn)差(RMSECV)衡量模型質(zhì)量, 篩選最佳模型, 并比較樣品預(yù)測值與化學(xué)值的決定系數(shù)(R2)和均方差(Mean Square Deviation, MSD)來衡量模型的質(zhì)量。

1.2.4 模型的外部驗(yàn)證 選取20個(gè)蔗糖含量顯著差異的花生品種(系), 利用建立的近紅外方法檢測其蔗糖含量, 記錄近紅外模型的預(yù)測值, 再利用液相色譜法(HPLC)分析樣品的蔗糖含量, 比較NIR預(yù)測值與HPLC測定化學(xué)值的相關(guān)性和準(zhǔn)確性。

1.2.5 高糖高油酸品系選育過程 2015年春季,以普通油酸花生品種“吉花02-1-4” (蔗糖含量為4.0%)為母本, 高油酸品種“中花26” (蔗糖含量2.3%)為父本配制雜交組合, 并收獲F1種子。2015年秋季, 將F1種植于廣東湛江, 收獲F2種子。2016年春季, 使用近紅外檢測單粒F2種子中油酸含量, 選擇油酸含量在75%以上的種子, 種植于湖北武漢, 并收獲F3單株。2017年春季, 使用近紅外檢測F3單株種子油酸含量,選擇油酸含量在75%以上的單株, 種植于湖北武漢,收獲F4。2018年春季, 將收獲的F4按株系種植于武漢,調(diào)查農(nóng)藝性狀, 收獲F5, 2018年冬季, 將F5種植于海南三亞, 收獲F6株系。2019年, 利用本研究建立的單株蔗糖含量近紅外模型測定F6株系的蔗糖含量, 并經(jīng)液相色譜分析驗(yàn)證, 獲得蔗糖含量7%以上、油酸78%以上的優(yōu)良株系。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中蔗糖含量的化學(xué)分析結(jié)果

采用高效液相色譜法測定了185份花生籽仁的蔗糖含量, 樣品的蔗糖測定值見表 2。蔗糖含量平均4.82%, 變異范圍1.02%～8.48%, 標(biāo)準(zhǔn)差為1.96, 標(biāo)準(zhǔn)誤 0.011, 變異系數(shù) 40.66%, 表明本試驗(yàn)選擇花生材料的蔗糖含量分布范圍廣, 變異系數(shù)大, 代表性好。

2.2 近紅外模型構(gòu)建

采集的185份花生籽仁近紅外光譜如圖2所示,建模樣品近紅光譜曲線趨勢大致相同, 但不同樣品的吸收峰強(qiáng)度不同。表明花生小樣品杯掃描獲得的近紅外光譜圖可以用于花生籽粒蔗糖含量的定量分析。對花生中蔗糖的化學(xué)值和采集的近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合光譜處理, 采用偏最小二乘法(PLS)的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立數(shù)學(xué)模型, 反復(fù)采用內(nèi)部交叉驗(yàn)證剔除異常值, 通過比較模型決定系數(shù)(R2)和均方差(MSD)衡量模型質(zhì)量, 篩選最佳模型。去除異常值后, 176份樣品建立模型的決定系數(shù)(R2)為0.962, 均方差(MSD)為 0.383 (圖 3)。

表2 HPLC法測定的定標(biāo)樣品蔗糖含量化學(xué)值Table 2 Chemical values of sucrose content tested by HPLC

2.3 模型的外部驗(yàn)證

利用所建立的定標(biāo)模型, 用近紅外分析儀和化學(xué)方法對 20份沒有參加定標(biāo)的花生材料作為外部驗(yàn)證樣品集, 檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測效果。蔗糖含量的預(yù)測值與化學(xué)值的絕對偏差在-1.44%～0.72%之間, 決定系數(shù)(R2)0.947,t= 0.233

表3 花生種子蔗糖含量近紅外模型的驗(yàn)證Table 3 Validation of near infrared model for sucrose content in peanut seed (%)

2.4 模型在高含糖量、高油酸優(yōu)良品系中的應(yīng)用效果

2019年利用本研究建立的單株蔗糖含量近紅外模型, 測定了“吉花02-1-4×中花26”的168個(gè)F6株系的蔗糖含量, 并經(jīng)液相色譜分析, 獲得蔗糖含量6.8%以上、油酸78%以上的優(yōu)良株系(表3)。從表3可以看出, 獲得的高蔗糖材料的含油量均低于48%,最低的僅42%, 屬于低油品系, 油酸含量均在78%以上, 屬于高油酸材料。從圖5可以看出, 本研究篩選出的6份高蔗糖、低含油量、高油酸品系在莢果大小、每莢果粒數(shù)、莢果和籽仁形狀等食用品質(zhì)相關(guān)的指標(biāo)上也有很大差別, 具有培育成不同食用型花生品種的潛力。

3 討論

近年來, 花生油用和食用品質(zhì)及其遺傳改良受到越來越多的關(guān)注, 品質(zhì)指標(biāo)從最初的含油量、蛋白質(zhì)含量逐步擴(kuò)展到脂肪酸、氨基酸、蔗糖含量、白藜蘆醇含量等。雖然這些品質(zhì)指標(biāo)均建有精準(zhǔn)的化學(xué)測定方法, 但普遍費(fèi)時(shí)費(fèi)力, 因而推動了近紅外技術(shù)在花生品質(zhì)改良上的應(yīng)用, 針對不同的近紅外儀型號,國內(nèi)建立了多個(gè)品質(zhì)性狀的近紅外模型[13-14,16,18]。同時(shí), 模型檢測需要的花生籽仁量越來越少, 甚至建立了單粒籽仁主要脂肪酸含量的近紅外模型[15,19],模型預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性也越來越好, 顯著提升了品質(zhì)育種效率。本研究利用美國Unity公司的近紅外儀,建立了小樣品杯的蔗糖含量預(yù)測模型, 能對雜交后代早期的單株籽仁進(jìn)行檢測, 并具有較好的預(yù)測結(jié)果, 是對已有蔗糖含量模型的改進(jìn)和豐富[20-21]。為更好地進(jìn)行蔗糖含量的預(yù)測和種子純度分析, 在以后的工作中, 還需要建立單?；ㄉ崽呛康慕t外模型。

利用一個(gè)近紅外儀對多個(gè)品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行跟蹤檢測已經(jīng)成為可能。如本研究就同時(shí)利用了含油量、油酸含量、含糖量 3個(gè)近紅外檢測模型對同一樣品進(jìn)行檢測, 獲得了兼具高含糖量、低含油量、高油酸的優(yōu)良食用型花生新品系, 這得益于當(dāng)前花生重要品質(zhì)參數(shù)近紅外模型越來越豐富。隨著花生品質(zhì)研究的深入, 一些含量不高、目前關(guān)注較少、具有重要價(jià)值的品質(zhì)性狀也需要逐步建立近紅外預(yù)測模型。

本研究在2個(gè)蔗糖含量并不很高的花生品種吉花02-1-4 (4.0%)和中花26 (2.3%)的雜交后代中篩選出一批含糖量超過7%的優(yōu)良品系, 蔗糖含量表現(xiàn)出明顯的超親現(xiàn)象, 推測可能的原因是不同材料中控制蔗糖含量的位點(diǎn)不同, 雜交聚合產(chǎn)生了超親效應(yīng)所致。同時(shí), 我們也看到, 蔗糖含量高的品系普遍含油量顯著降低, 說明這一雜交組合中產(chǎn)生蔗糖含量超親的后代與含油量合成受阻直接或間接相關(guān), 因此, 深入研究高糖、低油品系形成的分子基礎(chǔ)也十分必要。另外, 雖然成熟花生種仁的蔗糖含量與總含糖量及甜度相關(guān), 但成熟花生種仁中還存在葡萄糖、果糖等其他糖類以及影響甜度的單寧等苦味成分, 這些成分對甜度亦有一定的正向和負(fù)向影響,食用型花生的甜味及適口性評價(jià)仍需在蔗糖含量測定的基礎(chǔ)上, 由經(jīng)過訓(xùn)練的人員進(jìn)行描述性感官風(fēng)味分析[3,5]。

4 結(jié)論

本研究利用籽仁蔗糖含量差異顯著的花生材料,構(gòu)建了花生籽仁蔗糖含量的小樣品杯近紅外定標(biāo)模型, 模型的決定系數(shù)R2= 0.962, 驗(yàn)證樣品集的決定系數(shù)為R2= 0.947, 可以較好地預(yù)測花生籽仁的蔗糖含量。利用該模型配合含油量、油酸含量近紅外模型, 高效的在“吉花02-1-4×中花26”雜交后代群體中發(fā)掘出6份高蔗糖、低油、高油酸、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的食用型花生新品系。