別明珂 曾昭文 陳新宇

〔摘要〕 目的 探討真武湯對慢性心力衰竭（chronic heart failure， CHF）大鼠心肌細胞細胞外信號調(diào)節(jié)激酶5（extracellular signal regulated kinase 5， ERK5）蛋白及線粒體自噬關(guān)鍵蛋白（PINK1、Parkin、Prohibitin2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）的影響。方法 SPF級SD大鼠52只，隨機抽取13只為正常對照組，剩余39只注射阿霉素（1.5 mg/mL溶液，2.0 mL/kg體質(zhì)量）6周造模。在首次注射阿霉素20 天后，對造模大鼠進行心臟彩超檢查，以評估造模的均衡性。按左室射血分?jǐn)?shù)將造模大鼠進行分層，并按隨機區(qū)組設(shè)計分為模型組、依那普利組和真武湯組，每組13只。藥物干預(yù)4周后，采用Western blot法檢測各組大鼠心肌細胞ERK5、p-ERK5蛋白及線粒體自噬關(guān)鍵蛋白（PINK1、Parkin、Prohibitin2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）表達水平。結(jié)果 造模6周后，模型組ERK5蛋白表達水平明顯低于正常對照組，線粒體自噬關(guān)鍵蛋白（PINK1、Parkin、Prohibitin2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）表達水平明顯高于正常對照組（P<0.05）;各治療組經(jīng)藥物干預(yù)4周后，線粒體自噬關(guān)鍵蛋白（PINK1、Parkin、Prohibitin2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）表達水平較模型組均有下降趨勢，ERK5蛋白表達水平較模型組均有上升趨勢（P<0.05），其中真武湯組與依那普利組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 真武湯可能通過上調(diào)心肌細胞p-ERK5表達水平，同時下調(diào)線粒體自噬關(guān)鍵蛋白的表達水平，從而發(fā)揮治療CHF作用。

〔關(guān)鍵詞〕 慢性心力衰竭;真武湯;細胞外信號調(diào)節(jié)激酶5;線粒體自噬;心肌細胞

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.12.005

Effects of Zhenwu Decoction on ERK5 and Key Proteins of Mitochondrial

Autophagy in Rats with Chronic Heart Failure

BIE Mingke1， ZENG Zhaowen2， CHEN Xinyu3*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The Second Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410300， China;

3. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of Zhenwu Decoction on extracellular signal regulated kinase 5 （ERK5） and key proteins of mitochondrial autophagy （PINK1， Parkin， Prohibitin2， LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ） in myocardial cells of rats with chronic heart failure （CHF）. Methods A total of 52 SPF degree SD rats were enrolled into the study， 13 rats were randomly selected as normal control group， and the remaining 39 rats were injected with doxorubicin （1.5 mg/mL solution， 2.0 mL/kg body mass） for 6 weeks for modeling. The model rats were subjected to a cardiac ultrasound examination in order to assess the equilibrium established in the animal model on the 20th day after the first doxorubicin injection. Model rats were underwent CHF model stratification according to left ventricular ejection fraction， and then were divided into 3 groups （model group， enalapril group and Zhenwu Decoction group） using a random block design， with 13 rats in each group. After treated with drugs for 4 weeks， the expression levels of ERK5， p-ERK5 and key proteins of mitochondrial autophagy （PINK1， Parkin， Prohibitin2， LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ） in cardiac myocytes of rats in each group were detected by Western blot. Results After 6 weeks of modeling， the expression of ERK5 in the myocardial cells of the model group was significantly lower than that of the normal control group， while the expression levels of key proteins of mitochondrial autophagy （PINK1， Parkin， Prohibitin2， LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ） were significantly higher than that of the normal control group （P<0.05）; after 4 weeks of drug intervention in each treatment group， the expression of key proteins of mitochondrial autophagy （PINK1， Parkin， Prohibitin2， LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ） had a downward trend compared with the model group， and the expression of ERK5 protein had an upward trend compared with the model group （P<0.05）. There was no significant difference between the naplepril group and Zhenwu Decoction group （P>0.05）. Conclusion Zhenwu Decoction may exert therapeutic effects on CHF by upregulating the expression level of p-ERK5 and downregulating the expression levels of key proteins of mitochondrial autophagy in cardiomyocytes.

〔Keywords〕 chronic heart failure; Zhenwu Decoction; extracellular signal regulated kinase 5; mitochondrial autophagy; cardiomyocytes

慢性心力衰竭（chronic heart failure， CHF）是各種心血管疾病的終末期表現(xiàn)和最主要的死亡原因[1]。隨著老齡化進程的加速，CHF患病率顯著升高[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，心肌細胞線粒體自噬失衡而引起的心肌細胞死亡是CHF過程中的重要機制。正常范圍的線粒體自噬能夠及時清除受損的線粒體，對心肌細胞具有保護作用;病理狀態(tài)下，心肌細胞線粒體自噬失衡，自噬小體過度激活，可直接誘導(dǎo)心肌細胞死亡，加重CHF病情[4]。

中醫(yī)藥在CHF的干預(yù)上具有獨特優(yōu)勢，中醫(yī)藥不僅能夠緩解臨床癥狀、降低藥物不良反應(yīng)，同時能夠降低CHF患者各項生化指標(biāo)、減輕心肌細胞壞死程度、改善心肌重構(gòu)，整體提高生存質(zhì)量[5]。真武湯出自東漢張仲景《傷寒論》，具有溫陽利水之功效。2014年中醫(yī)診療專家共識[6]針對CHF的中醫(yī)治療將真武湯作為推薦方之一。

課題組前期研究[7]顯示，MAPK/ERK5通路在CHF的進展過程中起到心肌保護作用。真武湯可通過拮抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system， RAAS）而降低CHF大鼠血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ， AngⅡ）水平，而AngⅡ可下調(diào)p-ERK5的表達。心肌細胞線粒體自噬與CHF密切相關(guān)，ERK5與線粒體自噬均可被氧化應(yīng)激、細胞毒性、缺血缺氧等外界刺激同時激活[8-9]。目前，關(guān)于真武湯治療CHF的研究，多為臨床研究或網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方面，實驗研究機制較為單一，真武湯對心肌細胞線粒體自噬蛋白的調(diào)控有待進一步研究。據(jù)此，本實驗通過構(gòu)建CHF大鼠模型，探討真武湯對CHF大鼠ERK5及線粒體自噬關(guān)鍵蛋白的影響。

1 材料

1.1 ?實驗動物

SPF級健康6周齡雄性SD大鼠52只（由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證批號：SCXK（湘）2016-0002），體質(zhì)量（200±20） g。在自由飲食、光/暗周期為12 h/12 h（光照時間為6：00～18：00）、背景噪聲為（40±10） db、溫度（20±3） ℃條件下飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。本研究倫理審查由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心批準(zhǔn)，飼養(yǎng)及實驗地點為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級實驗室。

1.2 ?主要藥物與試劑

真武湯（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院新綠藥）按照謝鳴主編的《方劑學(xué)》[10]教材的推薦劑量：炮附子9 g，白術(shù)6 g，白芍9 g，茯苓9 g，生姜9 g，用蒸餾水溶化而成。鹽酸阿霉素（深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號：1703E1）;馬來酸依那普利片（揚子江藥業(yè)集團江蘇制藥股份有限公司，批號：H32026567）;PINK1抗體（批號：23274-1-AP）、Prohibitin2抗體（批號：12295-1-AP）、LC3抗體（批號：14600-1-AP）均購自美國Proteintech公司;Parkin抗體（批號：ab179812）、ERK5抗體（批號：ab40809）、p-ERK5抗體（批號：ab5686）均購自英國Abcam公司。

1.3 ?主要儀器

臺式冷凍離心機（深圳黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司，型號：TGL-18R）;電泳儀（美國Bio-rad公司，型號：164-5050）;轉(zhuǎn)膜儀（型號：DYCZ-40A）、電泳槽（型號：DYCZ-24EN）均購自北京六一生物科技有限公司;電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司，型號：FA-N）;精密pH計（中國雷磁分析儀器廠，型號：E-201-C）;普通冰箱（中國榮事達電子電器集團，型號：BCD-245F）;彩色多普勒超聲診斷儀（美國西門子公司，型號：ACUSONSequoia 512）;電磁爐（美的集團，型號：MC-EP186）;切片機（金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號：YD-202III）;包埋機（常州市中威電子儀器有限公司，型號：BMJ-Ⅲ）;旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：QL-901）;電動玻璃勻漿器（日本新芝公司，型號：DY89-1）。

2 方法

2.1 造模及分組

SPF級SD大鼠52只先飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境，隨機抽取13只作為正常組。1周后對除正常組以外的所有大鼠用阿霉素進行造模[11]。首先用生理鹽水將阿霉素配制成1.5 mg/mL溶液，以2.0 mL/kg體質(zhì)量進行腹腔注射，每周1次，連續(xù)注射6周，累積每只大鼠注射阿霉素總量18 mg/kg，每次造模前重新稱重，作為該次用藥劑量的計算標(biāo)準(zhǔn)。

為評估動物模型建立的均衡性[11]，將余下39只大鼠在首次注射阿霉素后第20天（第3次注射阿霉素后第6天），進行心臟彩超檢查。根據(jù)大鼠左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction， LVEF）先進行分層，然后通過隨機區(qū)組設(shè)計平均分為3組，每組13只，分別為模型組、依那普利組和真武湯組。

2.2 ?給藥

自實驗開始造模的第21天開始，除正常組外，所有大鼠繼續(xù)用配置好的阿霉素溶液進行腹腔注射，每周1次，連續(xù)3周;同時真武湯組予以真武湯4.4 g/（kg·d），用水配成混懸液灌胃，給藥劑量參考《藥理實驗方法學(xué)》[12]，根據(jù)成人與大鼠體表面積進行換算（D成人=K·D大鼠），換算系數(shù)K為6.25。依那普利組予以馬來酸依那普利片1.8 mg/（kg·d），用水配成混懸液灌胃，正常組和模型組均予以等量蒸餾水灌胃，每天2次，各組連續(xù)灌胃4周。

2.3 ?指標(biāo)記錄及檢測

2.3.1 ?一般情況 ?給藥后，每周測定大鼠體溫、體質(zhì)量，詳細記錄進食數(shù)量和飲水情況。

2.3.2 ?心臟彩超檢查 ?所有實驗大鼠在稱重后依次分批麻醉，備皮，然后取平臥位固定于手術(shù)臺上，將彩超探頭置于胸骨左側(cè)心尖部，并指向右上方心底部，找到左室長軸切面，然后用M型超聲計算出LVEF及左室縮短分?jǐn)?shù)（left ventricular fractional shortening， LVFS），連續(xù)測量5次，然后取平均值，所有測量由同一個操作者完成。

2.3.3 ?血清學(xué)指標(biāo)檢測 ?血清NT-proBNP表達的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附測定法。取各組大鼠腹主動脈血，將采集的血靜置10 min后以用離心機按轉(zhuǎn)速3000 r/min離心15 min，離心半徑6.75 cm，接著用移液槍吸取上層血清，置于EP管中，并進行標(biāo)記、編號，放置于-20 ℃冰箱待檢。檢測具體操作按試劑盒標(biāo)準(zhǔn)說明進行。

2.3.4 ?蛋白表達水平檢測 ?采用Western blot法檢測，首先將100 μg樣品總蛋白加入5×Loading buffer混勻，接著置于沸水中煮5 min，再置于冰盒中速冷，經(jīng)蛋白變性后開始電泳。在電泳結(jié)束后設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300 mA。轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜取出放入1×TBST沖洗5 min。然后將膜浸入1×TBST配制5%脫脂奶粉中，室溫封閉1.5 h。取出膜，置于一雜交袋中，分別加入ERK5抗體（稀釋比例1∶10 000）、p-ERK5抗體（稀釋比例1∶1000）、PINK1抗體（稀釋比例1∶700）、Parkin抗體（稀釋比例1∶2000）、Prohibitin2抗體（稀釋比例1∶800）、LC3抗體（稀釋比例1∶2000），GAPDH抗體（稀釋比例1∶3000），4 ℃過夜。孵育結(jié)束，1×TBST洗3次，每次15 min。用1×TBST稀釋HRP標(biāo)記的二抗（稀釋比例1∶6000），將稀釋后的二抗與膜共同孵育90 min。孵育結(jié)束，1×TBST再次沖洗3次，每次15 min。ECL顯色曝光、掃描、保存。運用Quantity one專業(yè)灰度分析軟件，將各個目的蛋白與GAPDH的灰度值的比值進行統(tǒng)計分析。

2.3.5 ?組織形態(tài)學(xué)觀察 ?取心臟左室面組織在光鏡下觀察其細胞形態(tài)，將固定后的心肌組織進行脫水、透明、包埋、切片、染色等程序，封片后于400倍光鏡下觀察染色效果并拍照。

2.4 ?統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料用“x±s”表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析檢驗，先用Levene檢驗方法對實驗數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，方差齊時，采用LSD法進行兩兩比較;方差不齊時，采用Tamhane’ T2法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?各組一般情況觀察

正常組：大鼠精神狀態(tài)正常，對各種刺激反應(yīng)靈敏，皮膚黏膜紅潤有光澤，全身毛發(fā)潤澤，進食、二便正常，飼養(yǎng)過程中體質(zhì)量逐漸增加。大鼠未出現(xiàn)死亡。

模型組：大鼠精神怠倦，對外界反應(yīng)遲鈍，皮膚黏膜蒼白，毛發(fā)不榮，進食量明顯減少，體質(zhì)量前期較正常組增長緩慢，中期停止增長，后期有一定下降，有不同程度腹腔積液，少數(shù)嚴(yán)重腹腔積液，偶有大便不成形。大鼠實驗過程中死亡3只，考慮阿霉素細胞毒性原因。

依那普利組和真武湯組：大鼠精神狀態(tài)、刺激反應(yīng)以及皮毛光澤度較正常組大鼠差，較模型組稍好，皮毛欠光澤，體質(zhì)量增加減慢，多數(shù)大鼠有輕度腹腔積液。兩組大鼠各死亡2只，對死亡大鼠進行解剖，未發(fā)現(xiàn)肺部液體殘留，考慮阿霉素細胞毒性原因。

3.2 ?各組大鼠心臟彩超測量結(jié)果

與正常組相比，其余各組LVEF、LVFS均顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，各治療組LVEF、LVFS均顯著升高（P<0.05）;依那普利組與真武湯組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

3.3 ?各組大鼠血清NT-proBNP水平比較

與正常組相比，其余各組血清NT-proBNP水平均有不同程度增高（P<0.05）;與模型組比較，各治療組血清NT-proBNP的水平均上升（P<0.05）;依那普利組與真武湯組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

3.4 ?各組大鼠心肌細胞ERK5、p-ERK5及線粒體自噬關(guān)鍵蛋白表達水平比較

各造模組心肌細胞ERK5、p-ERK5表達水平明顯低于正常組，而線粒體自噬關(guān)鍵蛋白表達水平明顯高于正常組（P<0.05）;各治療組p-ERK5表達較模型組明顯上升，而線粒體自噬關(guān)鍵蛋白表達水平較模型組顯著下降，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;真武湯組與依那普利組心肌細胞ERK5、p-ERK5及線粒體自噬關(guān)鍵蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3-4、圖1。

3.5 ?各組大鼠心肌細胞形態(tài)學(xué)變化

正常組大鼠心肌纖維排列整齊，橫紋清晰，間質(zhì)無充血、無炎細胞浸潤;模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，細胞水腫明顯，橫紋不清晰;依那普利組大鼠心肌纖維稍紊亂，細胞稍水腫，橫紋欠清晰;真武湯組大鼠心肌纖維排列尚整齊，橫紋欠清晰，細胞間隙增寬。見圖 2。

4 討論

CHF患者5年的病死率可達50%，10年病死率超過90%，作為一種復(fù)雜的臨床癥狀群，嚴(yán)重危害全世界人民的生命健康[13-14]。線粒體自噬與CHF的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，正常水平的線粒體自噬對心肌細胞具有保護作用，過度的線粒體自噬，可使線粒體消耗增加，導(dǎo)致心肌細胞脫落以及CHF的發(fā)生[15]。ERK5能維持正常心血管系統(tǒng)的內(nèi)皮完整性，拮抗內(nèi)皮細胞的凋亡，促進血管再生[16]。CHF病理狀態(tài)下p-ERK5表達顯著下調(diào)，同時伴隨心肌細胞線粒體自噬明顯增強，整體表現(xiàn)為心肌細胞過度丟失而使得CHF加重。臨床觀察[17]和基礎(chǔ)實驗[18]均已證明，在CHF發(fā)病過程中，過量活性氧的釋放可激活炎性因子網(wǎng)絡(luò)，進而影響p-ERK5表達，加重心肌損傷。ERK5與心肌細胞線粒體自噬均可被相同的外界刺激激活（主要為氧化應(yīng)激和缺血缺氧）。

CHF在中醫(yī)理論中可歸屬于“心悸”“喘證”“心水”范疇，以心悸、氣喘、肢體水腫為主要表現(xiàn)。其根本病機為心氣不足、心陽虧虛，以心氣虛衰為本，水飲內(nèi)停為標(biāo)，患者多見素體陽虛，因外邪、情志、過勞而復(fù)傷心體，心氣不足，無以行血，血不利而為水，水津循環(huán)不暢，停留周身[19]。真武湯出自《傷寒論》，是治療陽虛水泛證的經(jīng)典方。其組成為：制附子、白術(shù)、茯苓、生姜、白芍，共5味中藥，秉承扶陽之要旨。其中，附子具有回陽救逆、補火助陽之功;茯苓淡滲利濕、健脾寧心;白術(shù)溫補中焦以絕水之源;生姜走而不守，與附子相伍加強溫陽散寒之力，又助茯苓、白術(shù)以溫散水氣;芍藥味酸收斂，制約諸藥之剛燥。全方共奏溫陽利水之功，使陽復(fù)陰化，切中病機。

在中醫(yī)藥臨床實踐中，真武湯被廣泛用于治療CHF[20-21]。然而CHF發(fā)病機制復(fù)雜，目前已發(fā)現(xiàn)其受到氧化應(yīng)激、心血管炎癥、血管內(nèi)皮損傷、RAAS激活、心室重塑、遺傳因素等多種機制的共同作用，中藥具有多靶點、多途徑的特點，真武湯治療CHF的作用機制有待進一步研究。前期研究[22]中，課題組發(fā)現(xiàn)溫陽振衰顆?？赏ㄟ^調(diào)控線粒體自噬對CHF具有治療作用?；诖?，對同樣具有溫陽化氣作用的真武湯治療CHF的作用機制進行探討。

實驗后，各模型組大鼠 LVEF、LVFS 值明顯降低，血清NT-proBNP水平明顯升高，提示心衰模型復(fù)制成功。CHF模型大鼠經(jīng)真武湯干預(yù)后，LVEF、

LVFS顯著升高，血清NT-proBNP水平明顯下降，驗證了真武湯對CHF具有治療作用。與正常組比較，經(jīng)阿霉素誘導(dǎo)的CHF模型大鼠心肌細胞p-ERK5表達水平顯著下降，而線粒體自噬關(guān)鍵蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，經(jīng)過連續(xù)4周的藥物干預(yù)，p-ERK5表達水平有了顯著上升，而線粒體自噬關(guān)鍵蛋白表達水平明顯下降（P<0.05）。

綜上所述，真武湯能夠提高p-ERK5表達水平，調(diào)控心肌細胞線粒體自噬的程度。通過上調(diào)ERK5表達，進而抑制線粒體自噬水平，可能是真武湯治療CHF的重要機制之一。

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〔收稿日期〕2021-03-05

〔基金項目〕國家自然科學(xué)基金項目（81173213）;湖南省重點領(lǐng)域研發(fā)計劃項目（2019SK2321）;湖南省高等學(xué)?！半p一流”建設(shè)項目;湖南中醫(yī)藥大學(xué)校級科研基金項目（ZYYDX201725）。

〔作者簡介〕別明珂，男，在讀博士研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治心腦血管疾病研究。

〔通信作者〕*陳新宇，男，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：chenxinyuchen@163.com。