◎ 黃綺敏，劉賢釗，馮華業(yè)，江志鵬，黃照榮

（無限極（中國）有限公司，廣東 江門 529100）

葛根是豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根[1]。葛根提取物是以葛根為原料，經(jīng)水提取、過濾、濃縮、干燥等工序制成的提取物。葛根提取物中含有葛根素等成分。葛根具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽止瀉、通經(jīng)活絡和解酒毒的作用[2-6]。國內外目前均未有葛根提取物的官方質量評價方法。本研究建立了葛根提取物中葛根素含量測定方法，測定了不同產(chǎn)地的葛根提取物中葛根素含量，為初步評價葛根提取物的質量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根素標準品（CAS號3681-99-0，批號201816，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇為色譜純（德國Merck公司）；其他試劑均為分析純；水為純化水。葛根提取物（取適量的葛根藥材加8倍量水煎煮3次，過濾，合并濾液，70 ℃減壓濃縮，噴霧干燥而得）。8批葛根提取物來源于兩個廠家，編號為1～8。

1.2 儀器與設備

Thermofisher UltiMate 3000高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器，美國ThermoFisher公司）；Fisherbrand FB11209型超聲波清洗儀（美國ThermoFisher公司），瑞士Mettler XPR2型百萬分之一電子天平。

1.3 方法

1.3.1 葛根素的含量測定

（1）對照品溶液配制。精密稱取葛根素對照品12.5 mg于100 mL容量瓶中，加入30%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，得到濃度為125 μg·mL-1葛根素對照品儲備液。

（2）供試品溶液配制。精確稱取混合均勻的葛根提取物樣品0.1 g，置于100 mL容量瓶中，加入30%乙醇約80 mL，超聲（250 W，40 Hz）處理30 min，取出，冷卻至室溫，加30%乙醇定容至刻度，搖勻。取上清液1 mL或5 mL容量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，即為稀釋5倍的測試液。取適量樣液過0.45 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液，供液相色譜分析。

（3）葛根素含量測定。分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測定。根據(jù)對照品溶液和供試品溶液色譜圖中的葛根素峰面積計算供試品中的葛根素含量。色譜柱：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（25∶75，體積比）；波長250 nm；柱溫35 ℃；流速1.0 mL·min-1；進樣量10 μL；理論塔板數(shù)按葛根素計不低于4 000。

1.3.2 方法學考察

（1）線性關系考察。精密稱取葛根素對照品13.10 mg于100 mL容量瓶中，加入30%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，得到濃度為124.97 μg·mL-1對照品儲備液。精密吸取葛根素對照品儲備液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL和5.0 mL分別至10 mL容量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，標準曲線工作液濃度為6.25 μg·mL-1、12.50 μg·mL-1、24.99 μg·mL-1、37.49 μg·mL-1、49.99 μg·mL-1和62.49 μg·mL-1。在規(guī)定的色譜條件下進行液相色譜分析，以峰面積對濃度制作標準曲線，求出線性回歸方程。

（2）精密度試驗。取1.3.1中（1）項制備的葛根素對照品溶液，重復進樣6次，分別計算峰面積及保留時間的RSD值。

（3）穩(wěn)定性試驗。精密稱取葛根提取物（批號CGG-C-A031912）0.102 8 g，并按1.3.1中（2）項條件制備供試品溶液，分別于0 d、2 d、4 d、6 d、12 d和24 d測定供試品溶液葛根素的峰面積。

（4）重復性試驗。精密稱取同批號葛根提取物（批號CGG-C-A031912）同一天內制備的6份供試品溶液，進行色譜測定。

（5）回收率試驗。取葛根素對照品165.493 mg置于100 mL容量瓶中，加30%乙醇溶解并定容，分別吸取該對照品溶液2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL各3組，分別加入已各自精密稱取同批號葛根提取物約0.05 g的9個100 mL容量瓶中，按1.3.1中（2）項條件制成供回收率測定用的供試品溶液，按1.3.1中（3）項進行測定，計算葛根素的回收率。

2 結果與分析

2.1 線性關系考察

以葛根素對照品濃度（μg·mL-1）為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作標準曲線，求出線性回歸程：Y= 0.7675X+0.049 8，R2=0.999 6。結果表明葛根素在6.25～62.49 μg·mL-1范圍內與峰面積呈良好的線性關系。結果如表1和圖1所示。

表1 葛根素標準曲線試驗結果表

圖1 葛根素標準曲線圖

2.2 精密度試驗

以葛根素計，保留時間和峰面積的RSD值為0.57%和0.28%，不對稱度不高于1.1，理論塔板數(shù)約6 000。表明儀器精密度良好。結果如表2所示。

表2 精密度試驗結果表（n=6）

2.3 穩(wěn)定性試驗

穩(wěn)定性試驗結果顯示，供試品中葛根素峰面積的RSD為0.22%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。結果如表3所示。

表3 穩(wěn)定性試驗結果表（n=6）

2.4 重復性試驗

葛根素平均含量為15.67%，RSD為0.56%。分離度＞1.5。表明該方法重復性良好。結果如表4所示。

表4 重復性試驗結果表

2.5 回收率試驗

平均回收率為102.78%（95%～105%），RSD值為1.55%，表明該方法準確度良好。結果如表5所示。

表5 回收率試驗結果表（n=9）

2.6 樣品含量測定

8批葛根提取物中葛根素含量在11.69%～15.67%，平均值約為13.9%，其中陜西A產(chǎn)地的含量最高，為15.47%～15.67%；安徽A產(chǎn)地的含量最低，為11.69%～12.55%，相同產(chǎn)地不同批次的葛根素含量數(shù)據(jù)差異較小。結果如表6所示。

表6 葛根提取物葛根素含量測定結果表

3 結果與討論

本次方法學驗證表明，葛根提取物中葛根素含量的高效液相色譜法的系統(tǒng)適應性、精密度、線性關系、準確度等均符合要求，該方法準確、可靠，可以作為葛根提取物中葛根素的含量測定方法。從上述研究表明，不同產(chǎn)地的葛根提取物的葛根素含量存在一定差異。這可能與葛根藥材的生長環(huán)境、采收時間、加工工藝等因素有關，有待進一步研究。