張馨允，郭啟倉(cāng)，張景義，許 穎

(1.河北省唐山市開灤總醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 唐山 063000；2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院心胸血管外科，河北 唐山 063000)

糖尿病腎病是糖尿病患者死亡增加的主要原因，也是造成終末期腎病的常見原因[1]，其病理特點(diǎn)是腎小球肥大、基底膜增厚、腎小球系膜擴(kuò)張、腎小球硬化和間質(zhì)纖維化[2]。氧化應(yīng)激是糖尿病的重要致病因素，通過損傷胰島β細(xì)胞和降低外周組織對(duì)胰島素的敏感性，導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生發(fā)展[3]?；钚匝?ROS)作為細(xì)胞內(nèi)信使，活化多種信號(hào)傳導(dǎo)通路，間接導(dǎo)致組織和細(xì)胞的損傷，誘導(dǎo)糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生如糖尿病腎病[4]。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)在氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)中起著重要作用。在病理狀態(tài)下，Nrf2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，激活下游血紅素氧合酶-1(HO-1)的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS水平以達(dá)到抗氧化作用。研究發(fā)現(xiàn)[5]，激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路能提高糖尿病腎病大鼠的抗氧化能力，說明Nrf2/HO-1信號(hào)通路介導(dǎo)的抗氧化在糖尿病腎病腎損傷中發(fā)揮腎保護(hù)作用。刺芒柄花素為紅車軸草中主要的異黃酮類化合物，具有抗炎抗氧化作用。研究發(fā)現(xiàn)[6]，刺芒柄花素通過抑制氧化應(yīng)激和促炎因子水平對(duì)急性腎損傷大鼠的腎毒性起一定的預(yù)防作用。因此，本研究初步探討刺芒柄花素對(duì)糖尿病腎病腎臟氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及其潛在機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)8周齡雄性SD大鼠75只，體質(zhì)量(250±30)g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(湘)2019～0017，在溫度18～26 ℃、相對(duì)濕度40%～70%、光暗交替循環(huán)12 h/12 h下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與藥物 刺芒柄花素(純度≥98%，批號(hào)CY180215，陜西慈緣生物技術(shù)有限公司)。鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ，純度≥98%，批號(hào)V900890，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；血肌酐(批號(hào)MAK080)、血尿素氮(批號(hào)MAK006)檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA，批號(hào)A003)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，批號(hào)A001-3)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px，批號(hào)BC1190)檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；RIPA裂解液(批號(hào)P0013C)、ECL化學(xué)發(fā)光試劑(批號(hào)P0018S)和BCA蛋白分析試劑盒(批號(hào)P0012S)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；TRIzol試劑(批號(hào)15596026，美國(guó)Invitrogen Life Technologies公司)；二氫乙錠熒光染液(批號(hào)sc-204724A，美國(guó)Santa Cruz公司)；逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒(批號(hào)K1691，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；熒光定量試劑盒[批號(hào)RR420 A，寶生物工程(大連)有限公司]；一抗兔抗Nrf2(批號(hào)ab92946)、鼠抗HO-1(批號(hào)ab13248)、鼠抗β-actin(批號(hào)ab8226)和兔抗Histone H3(批號(hào)ab1791)抗體(英國(guó)Abcam公司)。

1.3 儀器 活力型血糖儀(瑞士羅氏公司)；TBA-40FR全自動(dòng)分析儀(日本東芝公司)；Multiskan Sky 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；GelDoc XR凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；ABI 7500熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)；RM2235石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；BX51熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 采用多次小劑量腹腔注射STZ(40 mg/kg)持續(xù)5 d[7]構(gòu)建糖尿病大鼠模型，造模過程中出現(xiàn)死亡或造模不成功的予以補(bǔ)充或剔除，注射3 d后檢測(cè)血糖，若濃度>16.7 mmol/L[8]則認(rèn)定糖尿病模型建模成功，再繼續(xù)定期檢測(cè)血糖，剔除血糖緩解者并及時(shí)補(bǔ)充，4周后檢測(cè)大24 h尿蛋白水平，若>20 mg[9]，并且尿糖陽(yáng)性，則認(rèn)定糖尿病腎病模型建模成功。將造模大鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組(100 mg/kg)、刺芒柄花素低劑量組(10 mg/kg)、刺芒柄花素高劑量組(40 mg/kg)，每組15只，另選15只未經(jīng)任何處理的大鼠作為正常對(duì)照組，給藥組大鼠灌胃給予相應(yīng)藥物，正常對(duì)照組、模型組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)8周。治療8周后收集大鼠24 h尿液，處死后采集腎臟組織和血液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 大鼠生化指標(biāo)檢測(cè) 收集各組大鼠24 h尿液，測(cè)定24 h尿微量白蛋白排泄率(MAER)。空腹尾靜脈采血，采用血糖儀檢測(cè)空腹血糖水平，肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)試劑盒檢測(cè)血清Scr、BUN水平，全自動(dòng)分析儀檢測(cè)血脂水平，包括總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)。

2.3 大鼠腎組織氧化指標(biāo)檢測(cè) 取凍存于液氮中的大鼠腎組織，預(yù)冷生理鹽水制成10%組織勻漿后，按照試劑盒說明書檢測(cè)MDA水平及SOD、GSH-Px活性。

2.4 過碘酸雪夫(PAS)染色 取大鼠左腎組織，去包膜后切一半，置于4%甲醛固定液中固定，常規(guī)石蠟切片，脫蠟至水后浸入高碘酸溶液中，室溫孵育10 min，蒸餾水洗滌3次，室溫晾干，滴加Schiff染液，室溫孵育20 min，自來水沖洗5 min，蘇木素染色10 min，自來水沖洗5 min，二甲苯透明，加入中性樹膠封片，在顯微鏡下測(cè)量腎小球面積，計(jì)算腎小球基質(zhì)相對(duì)面積，公式為相對(duì)面積=(腎小球基質(zhì)面積/腎小球面積)×100%。

2.5 大鼠腎組織活性氧(ROS)檢測(cè) 取固定好的大鼠腎組織，常規(guī)制備成石蠟切片，在室溫下黑暗浸入10 μmol/L二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)溶液中孵育20 min，PBS溶液洗滌3次后，在熒光顯微鏡下觀察腎組織細(xì)胞中紅色熒光，根據(jù)紅色熒光強(qiáng)度可判斷ROS水平的變化情況[10]。

2.6 RT-qPCR法檢測(cè)大鼠腎組織Nrf2/HO-1 mRNA表達(dá) 取適量右腎組織，加入液氮研磨成碎塊，使用TRIzol試劑制備組織勻漿提取總RNA，取1 μg，用PrimeScript RT酶混合液反轉(zhuǎn)錄成cDNA，在85 ℃下孵育5 s。引物序列Nrf2正向5′-CCATTTACGGAGACCCAC-3′，反向5′-CTTATTTCA ACGGCGAGT-3′；HO-1正向5′-CCTCACTGGC AGGAAATCATC-3′，反向5′-CCTCGTGGAGACGC TTTACATA-3′；β-actin正向5′-ATGAAGTGTGACG TTACGC-3′，反向5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGC AC-3′。采用ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次，以β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因表達(dá)的相對(duì)量。

2.7 Western blot法檢測(cè)大鼠腎組織Nrf2/HO-1蛋白表達(dá) 取適量大鼠右腎組織至玻璃勻漿器中，每20 mg加入150 μL RIPA裂解液裂解組織抽提總蛋白，加入胞核提取緩沖液提取組織核蛋白，12 000 r/min離心15 min，收集上清液，BCA蛋白分析試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上，在室溫下用含5%脫脂奶粉的PBS溶液封閉1 h，加入一抗抗體Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)、Histone H3(1∶2 000)，4 ℃過夜孵育，PBS溶液清洗3次，在室溫下與辣根過氧化物酶結(jié)合的二級(jí)抗體孵育1 h，PBS溶液洗滌3次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液(ECL)顯影，以目標(biāo)條帶、內(nèi)參條帶灰度值的比值為相對(duì)蛋白表達(dá)量，分別以β-actin、Histone H3為內(nèi)參。

3 結(jié)果

3.1 刺芒柄花素對(duì)糖尿病腎病大鼠腎功能的影響 如表1所示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠24 h尿液MAER、血清Scr和BUN水平升高(P<0.01)；與模型組比較，刺芒柄花素高劑量組、二甲雙胍組大鼠24 h尿液MAER、血清Scr和BUN水平降低(P<0.01)，而刺芒柄花素低劑量組大鼠上述指標(biāo)無明顯變化(P>0.05)。

表1 刺芒柄花素對(duì)糖尿病腎病大鼠腎功能的影響Tab.1 Effects of formononetin on renal functions of rats with diabetic nephropathy n=15)

3.2 刺芒柄花素對(duì)糖尿病腎病大鼠血糖及血脂的影響 如表2所示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠空腹血糖及血清TG、TC、LDL、HDL水平升高(P<0.01)；與模型組比較，刺芒柄花素高劑量組、二甲雙胍組大鼠空腹血糖及血清TG、TC、LDL、HDL水平降低(P<0.05，0.01)，而刺芒柄花素低劑量組大鼠上述指標(biāo)無明顯變化(P>0.05)。

表2 刺芒柄花素對(duì)糖尿病腎病大鼠血糖、血脂水平的影響Tab.2 Effects of formononetin on blood glucose and blood lipid levels in rats with diabetic nephropathy n=15)

3.3 刺芒柄花素對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織病理變化的影響 如圖1A所示，正常對(duì)照組大鼠腎組織腎小球無明顯肥大增生等病理變化；模型組大鼠腎組織腎小球肥大、增生，系膜擴(kuò)張以及系膜基質(zhì)增多；刺芒柄花素高劑量組、二甲雙胍組大鼠腎組織損傷病理變化較模型組減輕，而刺芒柄花素低劑量組未明顯緩解。如圖1B所示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠腎小球基質(zhì)相對(duì)面積增加(P<0.01)；與模型組比較，刺芒柄花素高劑量組、二甲雙胍組大鼠腎小球基質(zhì)相對(duì)面積減少(P<0.01)，而刺芒柄花素低劑量組大鼠該指標(biāo)無明顯變化(P>0.05)。

注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖1 刺芒柄花素對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織病理變化的影響(×400)Fig.1 Effects of formononetin on renal tissue pathological changes of rats with diabetic nephropathy (×400)

3.4 刺芒柄花素對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織氧化指標(biāo)的影響 如表3、圖2所示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織MDA、ROS水平升高(P<0.01)，GSH-Px、SOD活性降低(P<0.01)；與模型組比較，刺芒柄花素高劑量組、二甲雙胍組大鼠腎組織MDA、ROS水平降低(P<0.05，P<0.01)，GSH-Px、SOD活性升高(P<0.05，P<0.01)，而刺芒柄花素低劑量組大鼠上述指標(biāo)無明顯變化(P>0.05)。

表3 刺芒柄花素對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織氧化指標(biāo)的影響Tab.3 Effects of formononetin on renal tissue oxidation indices in rats with diabetic nephropathy n=15)

3.5 刺芒柄花素對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織Nrf2/HO-1表達(dá)的影響 如表4～5、圖3所示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠Nrf2/HO-1通路受到抑制，腎組織Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白表達(dá)降低(P<0.01)；與模型組比較，刺芒柄花素高劑量組、二甲雙胍組大鼠Nrf2/HO-1通路激活，腎組織Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，而刺芒柄花素低劑量組大鼠Nrf2/HO-1通路無明顯變化(P>0.05)。

表4 刺芒柄花素對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)的影響Tab.4 Effects of formononetin on the renal tissue mRNA expressions of Nrf2 and HO-1 in rats with diabetic nephropathy n=15)

表5 刺芒柄花素對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)的影響Tab.5 Effects of formononetin on the renal tissue protein expressions of Nrf2 and HO-1 in rats with diabetic nephropathy n=15)

圖3 刺芒柄花素對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of formononetin on the renal tissue protein expressions of Nrf2 and HO-1 in rats with diabetic nephropathy

4 討論

糖尿病腎病是終末期腎功能衰竭的重要原因。糖尿病腎病患者的全因死亡率、心血管死亡率和腎功能衰竭的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[11]。據(jù)報(bào)道，糖尿病腎病患者24 h尿液MAER、血清Scr和BUN水平升高，導(dǎo)致疾病進(jìn)展[12]。在本研究中，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠在病程進(jìn)展4周后，出現(xiàn)24 h尿蛋白異常，尿液MAER、血清Scr和BUN水平均升高，光鏡下觀察到大鼠腎臟表現(xiàn)為腎小球肥大、增生以及系膜擴(kuò)張等病理變化，成功建立糖尿病腎病大鼠模型。

糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制是多因素的，高血糖介導(dǎo)的多種途徑失調(diào)導(dǎo)致機(jī)體增強(qiáng)氧化應(yīng)激強(qiáng)度，進(jìn)一步誘導(dǎo)器官組織損傷。因此，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是糖尿病腎病進(jìn)展的一個(gè)中心介質(zhì)。糖尿病腎病患者早期腎組織MDA水平升高，總抗氧化能力降低，腎組織中總抗氧化能力和MDA水平與腎組織學(xué)評(píng)分有良好的線性相關(guān)性[13]。說明在糖尿病腎病早期階段，糖尿病腎病患者的抗氧化能力已經(jīng)下降。本研究結(jié)果表明，糖尿病4周后腎組織中MDA水平升高，SOD和GSH-Px活性降低。糖尿病腎病大鼠腎臟的抗氧化能力隨著腎損傷的嚴(yán)重程度而減弱。Nrf2/HO-1信號(hào)通路作為氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)中的關(guān)鍵途徑，在糖尿病腎病病程發(fā)展中具有兩面性。一方面，Nrf2缺乏癥減輕了糖尿病小鼠的高血壓和腎病[14]；另一方面，激活Nrf2可預(yù)防糖尿病性腎病[15]。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病大鼠腎臟Nrf2和HO-1表達(dá)降低。綜合分析，Nrf2具有兩面性可能是由于在糖尿病腎病早期，腎組織Nrf2/HO-1信號(hào)通路激活促進(jìn)抗氧化酶生成，抵抗氧化應(yīng)激，保護(hù)糖尿病腎病誘導(dǎo)的腎損傷。隨著病程的發(fā)展，在糖尿病腎病后期，腎損傷情況越來越嚴(yán)重，此時(shí)Nrf2/HO-1介導(dǎo)的抗氧化作用無法控制損傷的發(fā)展，腎組織內(nèi)氧化、抗氧化動(dòng)態(tài)平衡破壞，氧化應(yīng)激占主導(dǎo)地位，因此腎組織內(nèi)Nrf2/HO-1信號(hào)通路被抑制。

刺芒柄花素在多種與氧化應(yīng)激相關(guān)的臨床病理模型中發(fā)揮抗氧化作用[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，刺芒柄花素能通過減輕病變腎臟腎盂積水，阻礙腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展保護(hù)腎間質(zhì)纖維化大鼠的腎功能[18]。研究發(fā)現(xiàn)[6]，刺芒柄花素在急性腎損傷大鼠中上調(diào)了腎組織Nrf2的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)和SOD活性增加。但在糖尿病引起的慢性腎病中，刺芒柄花素還未有相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，刺芒柄花素能有效降低糖尿病腎病大鼠血糖和血脂，提高腎組織抗氧化能力，減輕糖尿病腎病大鼠氧化應(yīng)激引起的腎損傷。同時(shí)，刺芒柄花素還能激活糖尿病腎病大鼠腎組織Nrf2/HO-1信號(hào)通路，結(jié)合之前的研究，可以推測(cè)刺芒柄花素對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織氧化應(yīng)激損傷的治療作用可能與Nrf2/HO-1信號(hào)通路的調(diào)控相關(guān)。

綜上所述，刺芒柄花素能減輕糖尿病腎病大鼠腎損傷，改善腎功能，降低血糖血脂，抑制腎組織氧化應(yīng)激，其機(jī)制可能與激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路有關(guān)。