曾 軍，周夏飛，張 維

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科(成都 610500)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)的主要病理學(xué)改變是由于肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)過度增殖和遷移導(dǎo)致的肺血管重構(gòu)，表現(xiàn)為細(xì)小動脈肌化、閉塞，中膜增厚，叢狀損害以及壞死性動脈炎[1]，目前其發(fā)病機制尚不清楚，治療手段有限。肌細(xì)胞增強因子2(myocyte enhancer factor 2，MEF2)是一種特定的轉(zhuǎn)錄因子，具有DNA 結(jié)合能力，與相關(guān)基因結(jié)合調(diào)控肌肉細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的增殖和分化，受表觀遺傳學(xué)機制調(diào)控。MEF2 基因家族由MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D4個成員組成。其中，MEF2C 在肌肉細(xì)胞的發(fā)育、分化、表型改變及增殖等方面發(fā)揮作用，可能參與PAH的發(fā)生、發(fā)展，但目前未闡明其具體機制[2-3]。有研究[4-7]表明，組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 4，HDAC4)可通過上調(diào)MEF2C，調(diào)節(jié)骨骼肌分化、增殖表型改變、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育,并與血管內(nèi)膜畸形增殖有關(guān)。因此，推測HDAC4可調(diào)控MEF2C介導(dǎo)的肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖。本研究通過干預(yù)小鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞的HDAC4蛋白功能，檢測HDAC4、MEF2C表達(dá)水平變化，并觀察小鼠肺動脈病理改變，以期為PAH分子機制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及分組 健康雄性BALB/C小鼠32只，8周齡，體重20～25 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)公司提供。隨機分為：陰性對照組(NC組)、PAH組、HDAC4抑制劑(HDAC4 inhibitor,HDAC4i)組、PAH+HDAC4i組，每組8只。

1.1.2 主要設(shè)備 Powerlab生理記錄儀、Millar微壓力導(dǎo)管(SPR-835)，均來自美國AD instruments公司。

1.1.3 主要試劑 MEF2C兔單克隆抗體(5030S, 美國CST)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)兔單克隆抗體(19245S, 美國CST)、骨橋蛋白(OPN)兔多克隆抗體(ab8448,英國Abcam)、HDAC4兔單克隆抗體(ab12172, 英國Abcam)、GAPDH兔單克隆抗體(ab181602,英國Abcam)、TB Green?Fast qPCR Mix試劑盒(RR430A,日本Takara)、HDAC4 inhibitor(S7617,美國Selleck)、野百合堿(B10942，上海士峰)、HDAC4i(美國 Selleck，商品名：Tasquinimod)。

1.2 動物模型建立方法

PAH組給予野百合堿60 mg/kg腹腔注射，HDAC4i組使用HDAC4i 30 mg/kg隔日灌胃(半衰期39 h)，PAH+HDAC4i組給予野百合堿60 mg/kg腹腔注射后，HDAC4i 30 mg/kg隔日灌胃，NC組經(jīng)腹腔注射等量生理鹽水。模型建立成功后第2周、第4周分批處死動物。小鼠斷頭法處死，留取肺組織及心臟組織樣本，生理鹽水清洗，右肺組織采用液氮保存，左肺組織采用中性福爾馬林固定。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 血流動力學(xué)指標(biāo) 乙醚吸入法麻醉小鼠并經(jīng)氣管插管通氣后，自下頜骨下方至胸骨上緣做頸正中部切口，充分暴露小鼠右側(cè)頸外靜脈，插入Millar微壓力導(dǎo)管，連接Powerlab 多通道生物信號記錄系統(tǒng)，經(jīng)頸外靜脈插管，右心導(dǎo)管法測定小鼠右心室壓力。測定右心室收縮壓(RVSP)、右心室舒張壓(RVDP)及右心室壓力升降最大速率(dp/dtmax)。測定連續(xù)10個心動周期壓力值，取均值作為實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3.2 右心室肥厚指數(shù) 小鼠右心室壓力測定后立即取出心臟，鹽水沖凈淤血，沿房室環(huán)剪去左右心房，沿室間隔邊緣分離右心室(RV)和左心室+室間隔(LV+S)，濾紙吸干心室上水分后立即稱重，RV/(LV+S)即右心室肥厚指數(shù)。

1.3.3 熒光定量PCR檢測MEF2CmRNA表達(dá) 1)引物設(shè)計：MEF2C正義鏈5′-CGGGATC CACTATGGGGAGAAAAAAGATTCAG-3′，反義鏈5′-CCGCTCGAGTGTTGCCCATCCTTCAG AGA-3′；β-actin正義鏈5′-CTGGCCGGGACCTG ACAGACT-3′，反義鏈5′-AGAAAGGGTGTAAA ACGCAGCTCA-3′。2)總RNA提取：取100 mg液氮凍存的小鼠右肺組織，立即放入預(yù)先裝有500 μL Trizol裂解液的1.5 mL PE管中，置于冰上，并用組織勻漿器快速破碎肺組織；常規(guī)使用氯仿-異丙醇抽提RNA。分光光度計測定RNA濃度、A260/A230、A260/A280。本研究中1.9≤A260/A280≥2.0時才考慮進(jìn)行后續(xù)實驗。3)反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳：取總RNA 1 μL，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒(日本Takara)合成cDNA第一鏈。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù)：37 ℃ 15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，85 ℃ 5 s(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))；4 ℃存儲。以反轉(zhuǎn)錄PCR 反應(yīng)的 cDNA為模板，添加量不超過 PCR 反應(yīng)液總體積的10%，取50 ng cDNA按照TB Green?Fast qPCR Mix(日本 Takara)說明書進(jìn)行操作。熒光定量PCR總反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃、預(yù)變性30 s，95 ℃、變性5 s，60 ℃、退火10 s，40個循環(huán)。擴增完成后，取10 μL PCR產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)分析儀進(jìn)行圖片掃描。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測MEF2C蛋白表達(dá) 40 mg凍存肺組織，加入400 μL RIPA裂解液，超聲破碎，隨后用移液器將裂解液移至1.5 mL離心管中，于95 ℃水中煮5 min，然后在4 ℃下，12 000 r/min，離心5 min(離心半徑6 cm)，取上清分裝于0.5 mL離心管中，并置于-20 ℃保存。取5 μL樣本使用BSA方法測定蛋白濃度。取50 μg總蛋白上樣進(jìn)行常規(guī)12% SDS-PAGE電泳，電泳開始時，恒壓模式下用80 V的電壓電泳，隨后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF 膜(恒流400 mA、轉(zhuǎn)膜時間75 min)，TBST洗滌后加5%脫脂牛奶-TBST，37 ℃封閉1 h，分別加入MEF2C兔抗鼠單克隆抗體稀釋液(1∶500)和GAPDH兔抗鼠單克隆抗體稀釋液(1∶1 000)，4 ℃搖床過夜，室溫下TBST洗滌3次，10 min/次。將MEF2C膜放入含有HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶4 000)稀釋液，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，10 min/次，ECL發(fā)光試劑顯影。MEF2C蛋白相對含量用MEF2C/GAPDH灰度比值表示。

1.3.5 肺組織病理分析 福爾馬林固定肺組織，常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟包埋，5 μm厚度切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，高倍光學(xué)顯微鏡下觀察肺動脈病理變化。每只小鼠均取5張切片，石蠟切片室溫放置1 h后常規(guī)脫蠟，微波法進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，分別滴加α-SMA兔單克隆抗體稀釋液(1∶400)、OPN兔多克隆抗體稀釋液(1∶200)、HDAC4兔單克隆抗體稀釋液(1∶400)，于4 ℃濕盒中孵育過夜。使用SP法進(jìn)行免疫組化染色，染色步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。DAB顯色3 min，Mayer HE染色復(fù)染1 min，梯度酒精逐漸脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照，棕黃色細(xì)顆粒狀即為陽性產(chǎn)物。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 RVSP 及RV/(LV+S)的變化

血流動力學(xué)監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，第2周PAH組、PAH+HDAC4i組及HDAC4i組RVSP分別為(24.785±1.289)、(27.983±1.215)、(24.332±0.964)mm Hg，高于NC組的(19.387±1.109)mm Hg(P<0.05)。第4周PAH組、PAH+HDAC4i組及HDAC4i組小鼠RVSP分別為(30.766±0.812)、(33.131±1.124)、(30.283±0.985)mm Hg，均高于NC組的(19.252±1.323)mm Hg(P<0.05)。在第2周PAH組、PAH+HDAC4i組及HDAC4i組小鼠的RV/(LV+S)分別為(0.297±0.011)、(0.330±0.016)、(0.291±0.005)，高于NC組的(0.250±0.011)(P<0.05)；第4周PAH組、PAH+HDAC4i組及HDAC4i組小鼠的RV/(LV+S)分別為(0.329±0.012)、(0.367±0.018)、(0.323±0.006)，均高于NC組的(0.245±0.006)(P<0.05)(表1)。

表1 各組RVSP及RV/(LV+S)比較

2.2 MEF2C mRNA及蛋白在小鼠肺組織中的表達(dá)

與NC組相比，第2周熒光定量PCR檢測顯示，PAH組、PAH+HDAC4i組MEF2CmRNA表達(dá)量均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與NC組相比，第4周熒光定量PCR檢測顯示，PAH組、PAH+HDAC4i組及HDAC4i組MEF2CmRNA表達(dá)量均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。免疫印跡實驗檢測結(jié)果顯示，在第2周、第4周，PAH組、PAH+HDAC4i組及HDAC4i組肺組織MEF2C蛋白表達(dá)量較NC組升高，且PAH+HDAC4i組肺組織MEF2C蛋白升高最明顯(表2～3、圖2)。

表2 第2周及第4周MEF2C mRNA相對表達(dá)量

表3 第2周及第4周MEF2C蛋白表達(dá)相對灰度值

圖2 小鼠肺組織MEF2C mRNA及蛋白表達(dá)量變化檢測結(jié)果

2.3 肺血管病理學(xué)改變及OPN、α-SMA、HDAC4蛋白在肺組織中定位表達(dá)

第4周PAH組、PAH+HDAC4i組及HDAC4i組小鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖、肥厚、排列紊亂；PAH+HDAC4i組肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖肥厚更加明顯，排列紊亂，血管管腔不對稱狹窄，并出現(xiàn)小動脈明顯肌化致管腔嚴(yán)重狹窄。OPN免疫組化顯示：PAH組、PAH+HDAC4i組及HDAC4i組主要在肺動脈平滑肌細(xì)胞可見胞漿黃染，且分布廣泛，而NC組肺動脈平滑肌細(xì)胞上分布淺淡。α-SMA免疫組化顯示：NC組肺動脈平滑肌細(xì)胞可見黃染顆粒，且分布廣泛，而PAH組、PAH+HDAC4i組及HDAC4i組肺動脈平滑肌細(xì)胞無黃染顆粒。HDAC4免疫組化顯示：NC組肺動脈平滑肌細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞可見染色較深，而PAH組、PAH+HDAC4i組及HDAC4i組肺動脈平滑肌細(xì)胞或肺泡上皮細(xì)胞染色明顯變淡(圖3)。

圖3 小鼠肺組織HE染色及免疫組化檢測OPN、α-SMA、HDAC4表達(dá)變化(×200)

3 討論

隨著對表觀遺傳學(xué)研究的深入，越來越多的研究[8]證明，PAH的發(fā)生、發(fā)展與表觀遺傳學(xué)有關(guān)，DNA 甲基化、組蛋白修飾可以選擇性調(diào)控細(xì)胞生長、增殖或凋亡。Kim 等[1]發(fā)現(xiàn)，一種組織特異性超氧化物歧化酶的表觀遺傳學(xué)改變導(dǎo)致肺動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)氧化還原信號異常，下調(diào)鉀離子通道的表達(dá)降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，抑制肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖。這為表觀遺傳學(xué)改變在PAH的發(fā)生發(fā)展中的作用提供有力支持。

Paulin等[3]研究提示，MEF2C可能參與PAH的發(fā)生、發(fā)展，但未能闡明其具體機制。研究[9]報道，MEF2C調(diào)控血管平滑肌增殖的作用是通過轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外信號，與輔助因子相互作用實現(xiàn)，組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)在這種細(xì)胞外信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演重要角色。HDAC是一類蛋白酶，對染色體的結(jié)構(gòu)修飾和基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著重要作用。一般情況下，組蛋白的乙?；欣贒NA與組蛋白八聚體的解離，核小體結(jié)構(gòu)松弛，從而使各種轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子能與DNA結(jié)合位點特異性結(jié)合，激活基因的轉(zhuǎn)錄。目前有研究[10]表明，HDAC4可通過對MEF2C的直接調(diào)控，調(diào)節(jié)骨骼肌分化、表型改變、心肌電活動、心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。在心肌電活動方面，ROS-HDAC4-MEF2C信號通路激活可誘發(fā)病竇綜合征。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究[11]中發(fā)現(xiàn)，HDAC4可以抑制MEF2C活性，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。關(guān)于軟骨成骨研究[4]發(fā)現(xiàn)，MEF2C的轉(zhuǎn)錄活性受HDAC4直接調(diào)控，HDAC4缺失可能導(dǎo)致MEF2C轉(zhuǎn)錄活性抑制失控從而出現(xiàn)過量成骨，在MEF2C基因敲除小鼠中證明了MEF2C在HDAC4軟骨成骨調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵性作用。在骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞中，HDAC4均可調(diào)控MEF2C表達(dá)，最終影響平滑肌細(xì)胞增殖。這種作用是通過HDAC4的泛素化及磷酸化調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的[6, 12]。在基因共轉(zhuǎn)染研究[5]中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MEF2C與HDAC4表達(dá)載體共同表達(dá)時，MEF2C的轉(zhuǎn)錄活性被明顯抑制，說明HDAC4抑制MEF2C介導(dǎo)的平滑肌增殖調(diào)控作用。有關(guān)肺血管研究[6]發(fā)現(xiàn)，HDAC4的活性也與MEF2C相關(guān)。

本研究顯示，PAH組、PAH+HDAC4i組及HDAC4i組小鼠RVSP與RV/(LV+S)均高于NC組。免疫印跡實驗結(jié)果表明，PAH組、PAH+HDAC4i組及HDAC4i組與NC組比較，MEF2C蛋白表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。免疫組化顯示，與NC組比較，PAH組、PAH+HDAC4i組及HDAC4i組小鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞OPN表達(dá)水平上升，而α-SMA與HDAC4表達(dá)水平明顯下降。同時，HE染色顯示，PAH組、PAH+HDAC4i組及HDAC4i組小鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖肥厚、排列紊亂；PAH+HDAC4i組肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖肥厚更加明顯，并出現(xiàn)小動脈明顯肌化致管腔嚴(yán)重狹窄。

綜上所述，本研究進(jìn)一步證明，HDAC4/MEF2C信號通路促進(jìn)PAH肺血管平滑肌細(xì)胞增殖，并再次證明MEF2C在PASMCs增殖中的關(guān)鍵性地位，此結(jié)果可為PAH的治療提供潛在理論依據(jù)。但本研究未在細(xì)胞水平證明HDAC4對MEF2C的具體調(diào)控機制，未來還需通過細(xì)胞實驗來進(jìn)一步驗證本研究假說?！?/p>