楊潔珂，李健春，林 曉，王人可，樊均明，2，王 麗△

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合研究中心(瀘州 646000); 2.成都醫(yī)學(xué)院(成都 610500)

腎臟纖維化是多種慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)的最終病理轉(zhuǎn)歸，也是CKD 進(jìn)展為終末期腎病(end-stage renal disease, ESRD) 的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年來(lái)，圍繞腎纖維化發(fā)生的機(jī)制研究較多，包括發(fā)現(xiàn)其與炎癥、巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和促纖維化通路(如TGF-β1/Smad3、Wnt/β-catenin等的異?；罨嘘P(guān)[1-2]，但確切機(jī)制尚不清楚。目前，臨床上雖可采用血液凈化手段緩解病情，但血透費(fèi)用昂貴，給患者家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且血透只能暫時(shí)延緩病情，故對(duì)于抗腎纖維化方法的研究已成為關(guān)系國(guó)民健康及社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要議題[3]。

生物信息學(xué)是一個(gè)將計(jì)算和分析工具應(yīng)用于捕獲、分析和解釋大量生物數(shù)據(jù)的全新科學(xué)領(lǐng)域。近年來(lái)，生物信息學(xué)分析在生命科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，高通量測(cè)序可同時(shí)提供各實(shí)驗(yàn)組中數(shù)千個(gè)基因的表達(dá)水平，直接獲取基因分子水平的信息?；谏镄畔W(xué)的微陣列和高通量測(cè)序已被廣泛用于預(yù)測(cè)各種疾病的潛在治療靶點(diǎn)[4]。本研究擬采用生物信息學(xué)方法，對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO) 小鼠模型的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，同時(shí)構(gòu)建UUO 3 d急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)和UUO 7 d CKD模型，并驗(yàn)證生物信息分析篩選出的與腎纖維化相關(guān)的核心基因，以期建立一種基于生物信息學(xué)分析篩選腎纖維化關(guān)鍵候選基因的方法，為CKD發(fā)病機(jī)制和抗纖維化治療靶點(diǎn)的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

儀器：Light CyclerR480Ⅱ PCR儀(Roche,瑞士)；ECL凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD,美國(guó))；VS120虛擬滑動(dòng)顯微鏡(Olympus,日本)。試劑：Trizol (invitrogen,美國(guó)，15596018)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒KitHiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper) (Vazyme,中國(guó)，7E34219)；尿素氮、血清肌酐定量試劑盒(南京建成, C013-2-1, C011-2-1)；HE染色試劑盒(Beyotime,中國(guó)，C0105)；Masson 三色染色液(Baso,中國(guó)，BA-4079B)；山羊抗小鼠IgG 抗體(北京中杉金橋, SP-9002); RELB、υCAM1、Pdlim1抗小鼠單克隆單抗(Santa cruz,美國(guó)，sc-393084、 sc-13160、 sc-48366)。

1.2 測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理及動(dòng)物造模

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nil.gov/geo/)下載序列號(hào)為GSE79443的基因表達(dá)譜，由Arvaniti等[5]提交，實(shí)驗(yàn)平臺(tái)基于GPL13112 Illumina HiSeq 2000(Mus musculus)平臺(tái)。GSE79443數(shù)據(jù)集包括假手術(shù)組樣本(4個(gè))，UUO組樣本(結(jié)扎2 d和8 d各3個(gè))。將下載的原始轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序數(shù)據(jù)(GSE79443)轉(zhuǎn)為fastq文件進(jìn)行質(zhì)控，以確保測(cè)序數(shù)據(jù)適合進(jìn)一步分析。使用STAR軟件將fastq文件轉(zhuǎn)為sam文件，samtools將sam文件轉(zhuǎn)為bam文件，隨后利用feature Counts軟件將bam文件轉(zhuǎn)count文件，以便用于后續(xù)差異表達(dá)基因分析。

同時(shí)，構(gòu)建UUO動(dòng)物模型對(duì)差異基因生物信息學(xué)篩選結(jié)果進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證。購(gòu)買(mǎi)SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠21只，8 周齡，體重均 20 g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(川) 2015-030]，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SYXK(川) 2018-065]。小鼠飼養(yǎng)于恒溫 20 ℃～22 ℃，濕度50%～60%環(huán)境中，每日光照、黑暗各12 h交替處理，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后構(gòu)建動(dòng)物模型，隨機(jī)分為假手術(shù)組、UUO 3 d組和UUO 7 d組。模型組予以右側(cè)輸尿管結(jié)扎，手術(shù)后3、7 d收集血清、腎臟進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(審批號(hào): 2019DW083)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程實(shí)行 3R 原則。

1.3 差異表達(dá)基因篩選

將預(yù)處理完成的counts數(shù)據(jù)運(yùn)用boxplot繪制箱型圖分析數(shù)據(jù)質(zhì)量分布，DESeq2歸一化后進(jìn)行差異基因分析, 設(shè)置P<0.01 和|log2FC|≥1，并使用Pheatmap軟件繪制熱圖。利用基因的表達(dá)計(jì)數(shù)文件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行成組對(duì)比分析，org.Hs.eg.db程序包和GENECODE 提供的注釋文件對(duì)篩選出來(lái)的差異表達(dá)基因進(jìn)行注釋。其篩選的條件設(shè)定為|log2Fold Change|>1、FDR<0.01 時(shí)，選取UUO 2 d和UUO 8 d相較于假手術(shù)表達(dá)的差異基因用于后續(xù)分析。

1.4 差異表達(dá)基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)

利用GSEA對(duì)基因集進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，對(duì)本研究中篩選的與腎纖維化密切相關(guān)的基因模塊進(jìn)行注釋?zhuān)剿髂K基因所參與的信號(hào)通路。

1.5 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)

WGCNA不僅可進(jìn)一步用于構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)，還可以檢測(cè)基因模塊并識(shí)別模塊內(nèi)的中心參與者(即中樞基因)[6]。對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因作WGCNA，構(gòu)建共表達(dá)模塊，分析并尋找與腎纖維化密切相關(guān)的關(guān)鍵基因模塊。進(jìn)一步使用Cytoscape 3.5.2 的插件cytohubba將各關(guān)鍵模塊連接度最高的前 20個(gè)基因制作蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 血清生化檢測(cè)和病理染色觀察

小鼠心臟采血后于4 ℃靜置過(guò)夜，隨后以3 000 r/min，離心半徑8.4 cm，離心15 min，吸取上層血清。準(zhǔn)備好收集的血清，按照操作說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)血清肌酐、尿素氮。新鮮腎臟組織經(jīng)過(guò)固定、脫水、包埋切片后，置于65 ℃烤箱烤片2 h，予以二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水。予以蘇木素滴染2 min，自來(lái)水沖洗；伊紅浸染1 min，自來(lái)水沖洗后行HE染色；予鐵蘇木素滴染5 min，自來(lái)水沖洗，麗春紅染色2 min，沖洗后予以磷酸鉬、苯胺藍(lán)復(fù)染，冰醋酸沖洗行Masson染色；脫水透明封片后，置于光鏡下觀察腎臟和腸道的結(jié)構(gòu)改變及腎臟纖維沉積情況。

1.7 Real-time PCR檢測(cè)差異基因表達(dá)水平

收集腎組織后，用Trizol法提取組織總 RNA。酶標(biāo)儀檢測(cè)所得總RNA的純度和濃度，再用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，最后進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)(表1)。設(shè)計(jì)反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min，40 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s)。每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)量3次，使用GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照。采用2-△△Ct法分析目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 Real-time PCR所用引物序列

1.8 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)蛋白水平

各組分別取適量腎臟皮質(zhì)于RIPA蛋白裂解液和PMSF混合液中裂解25 min提取總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法定量蛋白濃度，加Loading Buffer煮沸后上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5% BSA室溫封閉1 h，加入相應(yīng)的一抗RELB/υCAM1/Pdlim1 (1∶1 000)、GAPDH (1∶50 000)于4 ℃搖床過(guò)夜，次日加相應(yīng)的HRP偶聯(lián)的二抗 (1∶2 000)于室溫孵育1 h，滴加ECL發(fā)光液于Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)成像。以Image J軟件分析條帶灰度值，并計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)核心基因表達(dá)

取新鮮組織固定脫水、包埋、切片，脫蠟復(fù)水后放入pH 6.0的檸檬酸緩沖液中微波抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫，用3%過(guò)氧化氫孵育10 min，PBS 洗滌3次，5 min/次。滴加5% BSA 封閉15 min，滴加一抗，4 ℃濕盒孵育過(guò)夜。次日PBS 洗滌3次，5 min/次，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，PBS 洗滌 3 次，5 min /次，DAB 顯色，鏡下控制顯色時(shí)間，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。染核、水洗、脫水、透明、封片后置于光鏡下觀察抗原沉積情況。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 篩選差異表達(dá)基因

對(duì)從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控后繪制箱型圖(圖1A)，由此可看出各樣本數(shù)據(jù)質(zhì)量分布均勻，9個(gè)樣本中位數(shù)均約在同一水平，且各組數(shù)據(jù)的分布緊密程度類(lèi)似，均無(wú)溢出值，表示此原始數(shù)據(jù)質(zhì)量尚可。將各樣本基因表達(dá)情況繪制成熱圖(圖1B)，可見(jiàn)組內(nèi)各樣本同種基因表達(dá)趨勢(shì)一致，組間基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步兩兩組間分析可見(jiàn)，假手術(shù)組、模型組間基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，UUO 2 d和UUO 8 d組間部分基因比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1C)。進(jìn)而選取兩個(gè)模型組間存在差異表達(dá)，并與假手術(shù)組亦存在差異表達(dá)的1 503個(gè)基因用于后續(xù)分析(圖1D)。

圖1 原始數(shù)據(jù)的預(yù)處理和初篩

2.2 加權(quán)分析及中樞基因網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

利用WGCNA進(jìn)行一步法網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)的構(gòu)建，采用動(dòng)態(tài)剪切法，將高度低于0.25的基因模塊進(jìn)行合并，在排除代表未能分配到任何1個(gè)已知模塊中的灰色基因模塊后，共得到 4 個(gè)基因共表達(dá)模塊(圖2A)。其中碧綠色模塊和藍(lán)色模塊與腎纖維化相關(guān)性最高，分別從碧綠色模塊和藍(lán)色模塊中各挑選出連接度最高的前10個(gè)基因，繪制相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(圖2B～C)，提示這些基因在纖維化的疾病進(jìn)程中可能扮演著重要的角色。

圖2 差異表達(dá)基因的聚類(lèi)樹(shù)及中樞基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 差異表達(dá)基因的通路聚集

GSEA分析可用來(lái)評(píng)估已預(yù)先定義的基因集中的基因其在與表型相關(guān)度排行表中的分布趨勢(shì)，通過(guò)對(duì)初步篩選出來(lái)的差異表達(dá)基因進(jìn)行信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)：多個(gè)信號(hào)通路被激活，包括JAK-STAT3/上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化/TNF等信號(hào)通路(圖3A)。其中，這些基因最主要富集在上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化與炎癥應(yīng)答信號(hào)通路，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3B～C)；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，僅有少量信號(hào)通路被抑制(如氧化磷酸化信號(hào)通路)，提示這些基因主要參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和纖維化的形成。

圖3 差異表達(dá)基因的GSEA分析

2.4 小鼠腎功能的改變和病理?yè)p傷程度

與假手術(shù)組相比，模型組的血淸肌酐、尿素氮均明顯升高，UUO 3 d組肌酐升高較UUO 7 d組明顯，考慮3 d為急性損傷而7 d已遷延至CKD，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4A～B)；腎臟的HE染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組腎小球明顯萎縮硬化，腎小管擴(kuò)張明顯，伴隨腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落，且UUO 7 d組較UUO 3 d組損傷程度更重，腎小管明顯擴(kuò)張。Masson三色染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組間質(zhì)藍(lán)染明顯，提示發(fā)生了纖維化，且隨著模型時(shí)間延長(zhǎng)纖維化程度加重，提示UUO 3 d模擬的是AKI，而UUO 7 d更貼近CKD表現(xiàn)(圖4C)。

圖4 小鼠生化指標(biāo)和腎臟病理水平

2.5 核心基因表達(dá)水平驗(yàn)證

通過(guò)進(jìn)一步查閱相關(guān)資料和文獻(xiàn)篩選出Pdlim1、Arld5a、mlkl、IFR1、RELB、υCAM1 6個(gè)與纖維化進(jìn)程關(guān)系更為密切的基因。通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)假手術(shù)組和UUO組(3、7 d)小鼠腎臟中該6種基因的相對(duì)表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組這些基因表達(dá)均出現(xiàn)增高，且隨著模型嚴(yán)重程度的加重呈現(xiàn)明顯上調(diào)，與生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)的結(jié)果相一致。其中RELB、υCAM1、Pdlim1的表達(dá)量升高最為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5A)。進(jìn)一步對(duì)這3個(gè)分子進(jìn)行蛋白水平的檢測(cè)，蛋白質(zhì)印跡技術(shù)結(jié)果顯示，RELB、υCAM1、Pdlim1表達(dá)量隨模型時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5B～E)；免疫組織化學(xué)法染色觀察亦有同樣的發(fā)現(xiàn)，模型組均較假手術(shù)組表達(dá)量高，主要沉積在腎小管間質(zhì)及部分細(xì)胞核內(nèi)，且隨著模型嚴(yán)重程度的上升，3個(gè)分子的表達(dá)均呈現(xiàn)明顯上調(diào)(圖5F)。由此推測(cè)，RELB、υCAM1、Pdlim1 3種核心基因的表達(dá)與腎纖維化的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

圖5 核心基因的表達(dá)驗(yàn)證

3 討論

CKD發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，但最終都將發(fā)展為ESRD，且均伴隨不同程度的腎纖維化，二者有密不可分的聯(lián)系[7-8]。腎臟纖維化主要表現(xiàn)為腎小球硬化、腎小管萎縮和擴(kuò)張、腎小管間質(zhì)纖維化等[9]。由于間質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)積聚和腎小管萎縮是進(jìn)行性腎病的常見(jiàn)組織病理學(xué)特征，故UUO常作為CKD病理生理學(xué)研究模型[10]。本研究通過(guò)利用生物信息學(xué)分析了2 d和8 d的UUO差異表達(dá)的基因，即代表著從AKI進(jìn)展至CKD過(guò)程中差異表達(dá)的基因。

首先對(duì)差異基因進(jìn)行GSEA分析發(fā)現(xiàn)，差異基因主要富集在上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化與炎癥應(yīng)答信號(hào)通路。大量研究[9]表明，腎小管間質(zhì)纖維化是CKD形成的最重要的驅(qū)動(dòng)因素之一。腎損傷發(fā)生后，腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生各種生物活性分子，并通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)驅(qū)動(dòng)間質(zhì)性炎癥和纖維化，進(jìn)一步加重腎臟損傷。有研究[11]報(bào)道，過(guò)度的免疫炎癥應(yīng)答可導(dǎo)致CKD的發(fā)生并促進(jìn)病程向ESRD的發(fā)展。浸潤(rùn)的白細(xì)胞可通過(guò)損傷腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞或通過(guò)分泌大量趨化因子和細(xì)胞因子，上調(diào)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重腎損傷，促進(jìn)腎纖維化的形成[12-13]，這與本研究通過(guò)GSEA分析的結(jié)果一致。

本研究分析了WGCNA，并對(duì)聚類(lèi)樹(shù)中的20個(gè)中樞基因進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，從而篩選出RELB、υCAM1、Mlkl、Pdlim1、IRF1、Arld5a中樞基因作進(jìn)一步研究。通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RELB、υCAM1和Pdlim1基因的表達(dá)上調(diào)明顯。研究[14]表明，RELB可活化誘導(dǎo)一系列下游靶基因的表達(dá)，并參與腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、細(xì)胞侵襲和EMT，其作為NF-κB的亞基，在NF-κB的替代途徑中起著重要作用。有研究[15]明確指出，RELB可防御肺部疾病誘導(dǎo)的炎癥，而炎癥又與纖維化的形成有著密切關(guān)系。υCAM1編碼由細(xì)胞因子活化的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞表面唾液酸糖蛋白，介導(dǎo)白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。據(jù)研究[16]報(bào)道，υCAM1的表達(dá)增加可導(dǎo)致腎臟持續(xù)炎癥，最終誘導(dǎo)纖維化的形成。Pdlim1最為特殊，它是與細(xì)胞骨架相關(guān)的細(xì)胞質(zhì)蛋白，可參與成纖維細(xì)胞中應(yīng)力纖維的組裝、拆卸和定向。有研究[17-18]發(fā)現(xiàn)，Pdlim1可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT和轉(zhuǎn)移，且敲低后可以逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞中磷酸化p65表達(dá)的減少和炎性細(xì)胞因子的分泌。但這與在生物信息學(xué)分析和腎臟組織中檢測(cè)的表達(dá)趨勢(shì)相反，未來(lái)將進(jìn)一步對(duì)Pdlim1在腎臟中發(fā)揮的作用進(jìn)行研究。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析和小鼠體內(nèi)驗(yàn)證，初步篩選到一些新的關(guān)鍵候選基因(RELB、υCAM1、Pdlim1)，為腎臟纖維化的干預(yù)治療提供新的理論依據(jù)。但后續(xù)仍需進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)外研究揭示這些基因的生物學(xué)功能以及在CKD疾病進(jìn)程中的具體作用機(jī)制。