陳炳宇，何 興，夏佳敏，鄒 蓉，黃四洲△

1.成都醫(yī)學(xué)院 人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室(成都 610500)；2.發(fā)育與再生四川省重點實驗室(成都 610500)；3.成都醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)院(成都 610500)

斑馬魚是一種淡水硬骨魚，自20世紀(jì)70年代有學(xué)者[1]使用斑馬魚作為模型生物以來，越來越多的實驗室開始使用這種模型生物作為疾病研究對象。由于斑馬魚的基因組與人類有70%的相似[2]，每次交配都會產(chǎn)生大量胚胎，且胚胎透明，有利于觀察研究。因此斑馬魚已成為用于大規(guī)模篩查臨床藥物的理想模型，同時該模型生物也在發(fā)育與再生等研究方面具有很好的運用前景。

絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(shmt)是調(diào)節(jié)一碳代謝中葉酸循環(huán)的關(guān)鍵蛋白，其家族包含細(xì)胞質(zhì)同工酶(shmt1)和線粒體同工酶(shmt2)兩種[3]。shmt1能催化將絲氨酸和四氫葉酸轉(zhuǎn)化為甘氨酸和5,10-亞甲基四氫葉酸[4-6]，并為核苷酸合成提供了單碳單元，影響DNA甲基化狀態(tài)和NADH/NADPH的產(chǎn)生[7-8]。2008年，研究者[9]發(fā)現(xiàn)，敲除shmt1蛋白表達的小鼠是可育的，隨后發(fā)現(xiàn)低葉酸飲食喂養(yǎng)的該突變體小鼠神經(jīng)管缺陷的發(fā)生率增加[10]，但shmt1基因在胚胎發(fā)育中的具體作用及調(diào)控機制尚未闡明。

研究[11]表明，細(xì)胞代謝相關(guān)的調(diào)控基因已成為新的癌癥診斷標(biāo)記和治療靶點，其中一碳代謝對于細(xì)胞代謝必不可少。在一碳代謝途徑葉酸循環(huán)、蛋氨酸循環(huán)和反硫化途徑3個關(guān)鍵反應(yīng)的葉酸循環(huán)中，葉酸及葉酸循環(huán)中間產(chǎn)物可以通過產(chǎn)生嘌呤和胸苷酸來調(diào)控癌癥細(xì)胞的生長和增殖[9]。根據(jù)2019年公共數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)挖掘和臨床標(biāo)本的驗證實驗[12]結(jié)果顯示，shmt1在肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表達明顯降低，并且與HCC患者的不良臨床特征和不良預(yù)后相關(guān)。也有研究者[4]選取268例人類肝活檢樣本進行功能基因組研究發(fā)現(xiàn)，許多單核苷酸多態(tài)性(SNP)與shmt1蛋白的表達相關(guān)[4]。除了發(fā)現(xiàn)shmt1調(diào)控肝癌發(fā)生，研究[13-16]表明，shmt1在肺癌、卵巢癌和乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮重要作用。shmt1在癌癥發(fā)生中的重要作用進一步暗示其在器官早期發(fā)育中可能發(fā)揮著不可或缺的作用。在本研究中，對斑馬魚shmt1基因進行了相關(guān)生物信息學(xué)分析，并研究了該基因在斑馬魚中的時空表達模式。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚飼養(yǎng)

本實驗所用斑馬魚均為AB品系，其飼養(yǎng)條件為28 ℃，光照周期為每天14 h光照、10 h黑暗。所有實驗均符合動物喂養(yǎng)及倫理使用要求，斑馬魚胚胎發(fā)育時期均按照 Kimmel等[17]研究的標(biāo)準(zhǔn)確定。

1.2 序列比對分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中收集了人類、小鼠和斑馬魚的shmt1蛋白氨基酸序列和核苷酸序列。氨基酸序列的登錄號如下：斑馬魚(登錄號: AAH66496)、人(登錄號:XP_016880446)、小鼠(登錄號:XP_006532707)。采用Mega7.0、ClustalW和GeneDoc等編輯軟件對序列進行比對分析。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Ensemble(http://asia.ensembl.org/index.html)數(shù)據(jù)庫收集了包含人類、小鼠、斑馬魚、家馬、鯽魚等11種不同物種的氨基酸序列(表1)。在bootstrap測試中，相關(guān)類群聚集在一起復(fù)制樹的百分比(1 000次重復(fù))顯示在分支旁邊[18]，使用Poisson校正方法計算進化距離[19]。用鄰域連接法(NJ)比較蛋白質(zhì)序列，利用mega 7.0軟件繪制進化樹。

表1 氨基酸登錄號

1.4 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過NCBI數(shù)據(jù)庫獲得shmt1人類、小鼠和斑馬魚蛋白序列，采用BLAST功能比對分析蛋白序列同源性，利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS(https://swissmodel.expasy.org/interactive)在線網(wǎng)站對shmt1蛋白氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析。

1.5 提取RNA和反轉(zhuǎn)錄定量PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)

收集不同時期的斑馬魚胚胎和成年組織樣本分別放在不同的離心管中，加入Trizol試劑(Invitrogen，美國)提取總RNA后,使用微量分光光度計(Nanodrop 2000,Thermo Scientific, 美國)測定RNA濃度和純度。再用the RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后用基因特定的引物shmt1 (5′-cactccaggtgtttgacatcat-3′和5′-ctgcaacaacagtccagtga c-3)′、β-actin(5′-cccagacatcagggagtg-3′和5′-tct ctgttggctttggga-3)和T3 Super PCR mix (TSINGKE)檢測斑馬魚目的基因的轉(zhuǎn)錄水平。PCR反應(yīng)擴增條件:98 ℃ 5 min，98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，28個循環(huán)。實驗結(jié)果利用GraphPad Prism 8.0和ImageJ軟件處理。

1.6 反義探針的制備

反義探針的模板以cDNA為模板，由正向引物5′-cagtatatgttgtcttgctaatgc-3′和反向引物5′-gattta ggtgacactatagaat ccatgtttggctgcactgtc-3′通過PCR得到DNA產(chǎn)物，并用DNA純化試劑盒(OMEGA,美國)回收。通過瑞士巴塞爾Roche公司的DIG RNA Labeling Kit(SP6/T7)試劑盒，按以下反應(yīng)體系制備反義RNA探針：DNA模板3 μL(0.8 μg)，Transcription Buffer(10×) 1 μL，Dig-labeled NTP mix(10×) 1 μL，SP6 RNA聚合酶 0.5 μL，RNase inhibitor 0.5 μL，加RNase-free water至10 μL，在37 ℃反應(yīng)2 h后加入0.5 μL SP6 RNA聚合酶，37 ℃反應(yīng)1 h，最后加入1 μL不含RNA酶的DNase I在37 ℃孵育30 min。

1.7 原位雜交

收集實驗所需時期的胚胎，在胚胎受精后24 h (hour post-fertilization,hpf)時加入0.03% PTU抑制色素生長，固定于4%多聚甲醛(PFA)中4 ℃固定過夜。第2天將胚胎置于PBST中洗滌3次，10 min/次。然后用100%甲醇脫水沖洗3次，10 min/次，最后加入1 mL甲醇放置于-20 ℃保存。具體操作步驟按照文獻[20]中的方法進行原位雜交實驗。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚shmt1序列的特征

shmt1位于3號染色體(ZDB-GENE-040426-1558)上，全長15 142 bp。shmt1基因含有12個外顯子，能合成481個氨基酸(圖1)。shmt家族有shmt1和shmt2兩種蛋白質(zhì)，參與包括含有葉酸的復(fù)合生物合成過程和四氫葉酸聚谷氨酸酯生物合成過程的許多生物過程。

圖1 斑馬魚shmt1基因外顯子結(jié)構(gòu)示意圖

從Ensembl(http://www.ensembl.org)數(shù)據(jù)庫中獲得了斑馬魚的shmt1氨基酸序列，到目前為止有shmt1-201(轉(zhuǎn)錄本：ENSDARP00000069223)、shmt1-202(轉(zhuǎn)錄本：ENSDARP00000121832)和shmt1-203(轉(zhuǎn)錄本：ENSDARP00000123687)3個轉(zhuǎn)錄本。shmt1-201全長1 858 bps，包括12個外顯子和11個編碼外顯子，編碼481個氨基酸；shmt1-202全長759 bps，包括7個外顯子和6個編碼外顯子；shmt1-203全長794 bps，包括6個外顯子和6個編碼外顯子，但shmt1-202和shmt1-203的cds區(qū)域不完整。通過對比發(fā)現(xiàn)，shmt1-201的氨基酸序列和NCBI數(shù)據(jù)庫上唯一的mRNA序列(登錄號：NM_201046)一致。因此，本研究只將NCBI數(shù)據(jù)庫中的shmt1基因序列(shmt1-201：ENSDARP00000069223)作為研究對象。

同時，使用NCBI 提供的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析數(shù)據(jù)庫對斑馬魚shmt1進行保守結(jié)構(gòu)域分析。結(jié)果表明，斑馬魚shmt1屬于天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AAT)超家族，且只含有1個保守結(jié)構(gòu)域(22-478a) 。

2.2 shmt1在物種間高度保守

為了分析斑馬魚shmt1蛋白在進化過程中的保守性，查詢NCBI數(shù)據(jù)庫獲得了人、斑馬魚和小鼠shmt1基因的氨基酸序列后，進行了多序列比對。利用ClustalW工具對3個shmt1基因的氨基酸序列進行比較發(fā)現(xiàn)，人與斑馬魚的相似性為79%，鼠與斑馬魚的氨基酸相似性為80%，人蛋白序列與小鼠的同源性高于人與斑馬魚(圖2)。

圖2 斑馬魚、人和小鼠中shmt1氨基酸的進化分析

2.3 斑馬魚shmt1的氨基酸序列進化分析

為了分析shmt1基因的進化關(guān)系，采用相鄰連接(neighbor-joining, NJ)方法，用mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行1 000個重復(fù)比對，結(jié)果顯示，斑馬魚shmt1和其他物種之間的同源性高度從64%到100%。一般來說，物種之間的同源性越高，序列之間的相似性就越高。因此，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹揭示的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系可知，斑馬魚shmt1與鯽魚(XP_026106171.1)的聯(lián)系最為密切，人與鼠之間的同源性高于人與斑馬魚，這一點從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹進一步證實人與鼠的進化距離更近(圖3)。

圖3 斑馬魚shmt1的系統(tǒng)進化樹分析

2.4 二級結(jié)構(gòu)

利用SOPMA網(wǎng)站對shmt1的魚、人、鼠蛋白氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析，結(jié)果顯示，shmt1蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成(圖4)。其中，斑馬魚中shmt1蛋白由46.57%α-螺旋、5.82%β-轉(zhuǎn)角、11.64%延伸鏈和35.97%無規(guī)則卷曲組成；人的shmt1蛋白由47.71%α-螺旋、5.42%β-轉(zhuǎn)角、12.08%延伸鏈和34.79%無規(guī)則卷曲組成；小鼠中的shmt1蛋白由46.44%α-螺旋、5.86%β-轉(zhuǎn)角、13.18%延伸鏈和34.52%無規(guī)則卷曲組成。由此可以看出，3種氨基酸序列結(jié)構(gòu)基本一致。

圖4 shmt1二級結(jié)構(gòu)預(yù)測示意圖

2.5 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

三級結(jié)構(gòu)決定了蛋白性質(zhì)，蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析對了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間的相關(guān)性至關(guān)重要。Swiss-Model是一款采用同源建模的方法預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的在線軟件，能夠預(yù)測蛋白質(zhì)電荷分布、原子間距離和角度等。將shmt1的氨基酸序列通過Swiss-Model網(wǎng)站預(yù)測出了3個結(jié)果，發(fā)現(xiàn)斑馬魚、人、小鼠之間差異微小，與模型蛋白比對覆蓋率依次分別為90%、92%、93%。結(jié)果顯示，斑馬魚、人、小鼠的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)基本一致(圖5)。

2.6 shmt1在斑馬魚胚胎和組織中的表達情況

為了研究shmt1在斑馬魚中的表達情況，從野生型的早期胚胎或成年魚組織中提取RNA，然后通過RT-PCR分析shmt1基因在胚胎發(fā)育和成年魚的表達情況。結(jié)果顯示，shmt1不僅在受精后胚胎發(fā)育的多個時期中均有不同程度表達(圖6A)，同樣也在成年魚的肝、腎、眼、性腺等各個組織中都有表達, 但在成年魚腎臟中的表達量最高(圖6B)。

圖6 shmt1在斑馬魚胚胎不同發(fā)育階段和不同組織中的表達

2.7 shmt1在斑馬魚胚胎發(fā)育早期的表達模式

運用原位雜交方法檢測斑馬魚shmt1在早期胚胎中的表達模式，結(jié)果表明shmt1是母源性表達因子，在胚胎發(fā)育8細(xì)胞時呈高表達( 圖7A) ；在芽胚時期，表達在卵黃多核層(圖7B)；24 hpf時,在鼻翼板中腦區(qū)、視頂蓋、視泡和卵黃多核層等多個地方表達；但從48 hpf～受精后3 d(day post-fertilization,dpf)，在肝臟和后腦中腦邊緣處特異性表達(圖7C～E)。以上數(shù)據(jù)表明，shmt1在胚胎發(fā)育早期可能參與了神經(jīng)、眼睛、肝臟發(fā)生的調(diào)控。

圖7 shmt1在斑馬魚中的表達圖譜

3 討論

本研究對斑馬魚shmt1基因進行了相關(guān)生物信息學(xué)分析。在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，絲氨酸被絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶催化轉(zhuǎn)化為甘氨酸，并將其甲基提供給5,10-亞甲基四氫葉酸，這種可逆反應(yīng)由shmt1和shmt2編碼的細(xì)胞質(zhì)和線粒體同工酶參與[4-6]。

通過公共數(shù)據(jù)庫NCBI和Ensemble進行檢索，發(fā)現(xiàn)shmt1位于3號染色體(ZDB-GENE-040426-1558)上，全長15 142 bp，含有12個外顯子，且能合成481個氨基酸。進行保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)斑馬魚shmt1屬于AAT超家族，且只含有1個保守結(jié)構(gòu)域(22-478a)。與此同時，從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得shmt1基因的不同物種氨基酸序列進行多序列比對，通過生物信息學(xué)分析鑒定了斑馬魚shmt1基因與其他11個不同物種的親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與本研究構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果一致，shmt1蛋白與其他11種物種具有高度同源性，并且人與小鼠的蛋白序列同源性高于人與斑馬魚的蛋白序列同源性。在其預(yù)測的二級蛋白和三級蛋白結(jié)構(gòu)中，也可以知道斑馬魚、人和小鼠3種氨基酸序列結(jié)構(gòu)基本一致。

整胚原位雜交結(jié)果顯示，shmt1在中腦區(qū)和視頂蓋處表達，暗示其在調(diào)控神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)相關(guān)疾病發(fā)生過程中有一定的功能。這一結(jié)論已有研究者[11]進行了相應(yīng)驗證，發(fā)現(xiàn)敲除shmt1蛋白表達的小鼠與神經(jīng)管缺損的小鼠模型雜交后，喂養(yǎng)低葉酸飲食的小鼠神經(jīng)管缺陷的發(fā)生率增加。另外，從原位雜交的結(jié)果觀察到，在48 hpf～3 dpf時shmt1在肝臟處特異性表達，提示其在肝臟發(fā)育和肝臟相關(guān)疾病發(fā)生中發(fā)揮重要的功能，但目前并未查閱到與shmt1基因在胚胎發(fā)育中的作用相關(guān)報道，僅發(fā)現(xiàn)shmt1在一些肝臟相關(guān)臨床疾病中有報道，比如shmt1在HCC中的表達降低，提示與HCC患者的不良臨床特征和不良預(yù)后相關(guān)[13]。在非酒精性脂肪肝患者中發(fā)現(xiàn)絲氨酸缺乏，且shmt1能成為治療非酒精性脂肪性肝炎的潛在治療靶點[21]。

綜上所述，shmt1是一母源性因子，在胚胎發(fā)育8細(xì)胞時期表達，從胚胎發(fā)育胚芽開始shmt1在卵黃多核層、鼻翼板中腦區(qū)、視頂蓋、視泡和肝臟多處集中表達，暗示shmt1可能參與了神經(jīng)、肝臟等發(fā)育的調(diào)控。本課題組今后將利用crisper技術(shù)構(gòu)建突變體，進一步探索該基因在神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟發(fā)育中的具體調(diào)控機制，以期為后續(xù)臨床研究和基礎(chǔ)研究提供更豐富的理論基礎(chǔ)。