王錦,張強*,張松,孫紅,黃巖

(1.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科， 2.腫瘤外科，安徽 蚌埠 233000)

前列腺素(prostaglandin，PG)是花生四烯酸的生物活性內(nèi)源性代謝物家族，具有多種生理功能，包括調(diào)節(jié)機體炎癥、細胞生長和分化。前列腺素D2(PGD2)是其中一個關鍵的調(diào)節(jié)因子[1]。PGD2合酶有兩種不同的同工型，即造血型和脂環(huán)蛋白型(L-PGDS)，L-PGDS是主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達的一種分泌蛋白；PGD2受體2(PTGDR2)主要在嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和Th2淋巴細胞中表達[2]。有研究結(jié)果表明，PGD2可抑制癌癥細胞的遷移和侵入，與肺癌和結(jié)腸癌血管生成有關，但國內(nèi)有關PGD2在胃癌中的表達及作用的研究不多[3]。本研究旨在探討L-PTGDS和PTGDR2在胃癌患者組織中的表達水平及其與臨床病理特征的相關性，有望能揭示胃癌新的治療靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2020年10月蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院收治的胃癌手術(shù)患者為研究對象，排除晚期復發(fā)轉(zhuǎn)移、肝腎功能障礙及術(shù)前接受化療治療患者。最終納入68例，其中男35例，女33例；年齡40～78歲，平均年齡(56.19±9.98)歲?；颊呒凹覍倬楸狙芯績?nèi)容并簽署同意書，本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會審批。

1.2 實驗方法

1.2.1標本取樣及處理 于患者行胃癌術(shù)中收集胃癌組織和及其癌旁正常組織標本(距離癌組織邊緣>5 cm)，所有標本經(jīng)病理檢查，去除標本壞死組織后以10%的中性甲醛進行固定和保存。

1.2.2實時熒光定量PCR 儀器采用CFX-96熒光定量PCR儀及其配套試劑盒，配制PCR反應體系。組織細胞總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄后，取l μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分裝入定量管中，加入1 μL cDNA，瞬離，使管內(nèi)液體沉淀，進行PCR擴增。設置反應條件及參數(shù)，根據(jù)反應的CT值，以β-actin作為對照，利用2-ΔΔCt法計算L-PTGDS和PTGDR2基因的相對表達水平。

1.2.3免疫組化 將脫蠟的4 μm厚切片與1%過氧化氫的甲醇溶液溫育30 min，用0.1%Triton X-100和3%的牛血清白蛋白在PBS溶液中處理15 min。一抗在4 ℃下處理過夜。洗滌后，將二抗處理3 h，然后與抗生物素蛋白-生物素過氧化物酶復合物反應。反應后，將切片用含有0.033%過氧化氫的0.02%3，3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽溶液處理。蘇木精復染3～5 min，30%蔗糖中脫水24 h脫水后在組織芯片上面滴入封固液以進行組織芯片封片，在400倍放大率下在顯微鏡下在4個隨機選擇的視野中對細胞數(shù)進行計數(shù)。

1.3 結(jié)果判斷

免疫組化陽性結(jié)果著色一般為黃色或棕黃色，把陽性信號的強度及頻度作為評價免疫組織化學檢測結(jié)果的指標，陽性強度(0～3)：陰性(0)、弱陽性(1)、陽性(2)及強陽性(3)；陽性頻率(0～4)：0%(0)、1%～25%(1)、26%～50%(2)、51%～75%(3)、76%～100%(4)。根據(jù)免疫組織化學檢測的結(jié)果綜合評分，分為4種程度：0分為陰性(-)、1～4分弱陽性(+)、5～8為陽性(++)、9～12分為強陽性(+++)[4]。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用兩獨立樣本t檢驗進行比較，計數(shù)資料以例(%)表示，采用χ2檢驗進行比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌組織和癌旁正常組織中L-PTGDS、PTGDR2基因相對表達量比較

胃癌組織L-PTGDS與PTGDR2相對表達量低于癌旁正常組織，兩組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 胃癌組織和癌旁正常組織中L-PTGDS、PTGDR2的相對表達量比較

2.2 胃癌組織和癌旁正常組織中L-PTGDS、PTGDR2表達情況比較

胃癌組織中L-PTGDS與PTGDR2陽性表達率均高于癌旁正常組織，兩組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 胃癌組織和癌旁正常組織中L-PTGDS、PTGDR2表達情況比較[n(%)，n=68]

2.3 胃癌組織L-PTGDS、PTGDR2表達情況與臨床病理特征的相關性

不同性別、年齡及分化程度的胃癌組織L-PTGDS、PTGDR2蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；不同腫瘤大小、TNM分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移者的胃癌組織L-PTGDS、PTGDR2蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表 3。

表3 胃癌組織L-PTGDS、PTGDR2表達情況與臨床病理特征的相關性 [n(%)]

3 討 論

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤，目前臨床上以化學治療為主，但由于大多數(shù)胃癌患者在診斷時已處于疾病晚期，治療效果并不理想[5]。隨著分子生物學技術(shù)的不斷進步，越來越多地研究表明，癌癥雖然具有共同的臨床表現(xiàn)，但其基因組具有巨大的復雜性[6]。進行胃癌基因分子學的研究，可對該病的診斷與治療帶來潛在影響。

L-PTGDS影響PGD2的分泌，而PTGDR2是PGD2的受體之一。有研究顯示PGD2可抑制AGS細胞的生長，PGD2代謝物15-脫氧Δ12-14-PGJ2抑制胃癌細胞系的細胞生長和誘導細胞凋亡[7～9]。為了確定L-PTGDS和PTGDR2在胃癌中的表達，本研究首先收集患者胃癌組織及胃旁正常組織，結(jié)果顯示，胃癌組織中的L-PTGDS和PTGDR2 相對表達水平均低于其對應的胃旁正常組織，且L-PTGDS和PTGDR2 的表達水平顯示出相似的趨勢，這說明兩組基因的低表達可能參與著抑制了癌癥細胞的集落形成和遷移。Zhang等[10]的研究表明，L-PTGDS和PTGDR2對胃癌生物學功能的抑制作用可以通過PGD2/PTGDR2信號傳導來完成，L-PTGDS和PTGDR2在PGD2誘導的胃癌細胞抑制中的關鍵作用。另外，胃癌組織中L-PTGDS與PTGDR2陽性表達率分別為72.06%和77.94%，明顯高于胃旁正常組織，進一步研究其分別與臨床病例特征的相關性，結(jié)果顯示，L-PTGDS與PTGDR2陽性表達情況與腫瘤大小、TNM分期、胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移具有顯著相關性，這提示L-PTGDS與PTGDR2可能參與著腫瘤的生長、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等生物過程。我們推測，L-PTGDS和PTGDR2在體內(nèi)抑制了腫瘤的發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移，且可能通過PGD2/PTGDR2信號傳導在體外限制了胃癌細胞的自我更新，PGD2具有抑制細胞生長的能力，是胃癌治療的重要潛在靶標。但是，目前有關PGD2控制胃癌細胞增殖的具體機制尚不清楚，且本研究僅限于體內(nèi)，有關PGD2在胃癌細胞株中的生物學功能實驗將在今后繼續(xù)開展。

綜上所述，L-PTGDS和PTGDR2在胃癌組織中的基因表達量明顯降低，且其蛋白陽性表達情況與腫瘤大小、TNM分期、胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移有關，L-PTGDS和PTGDR2在胃癌組織中的低表達可能導致外周血中PGD2表達降低，外周血中PGD2水平有望成為胃癌診斷中的新指標。