鄭俊斌

(廈門市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 廈門 361000)

據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，最常診斷出的癌癥是肺癌， 被納入研究的癌癥病例有11.6%的病例確診為肺癌，18.4%的癌癥總死亡人數(shù)是由肺癌造成的[1]。肺癌常見形式是非小細(xì)胞肺癌，肺腺癌則是非小細(xì)胞肺癌中最常見的變異型。據(jù)報(bào)道，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)至少占肺癌病例的80%，這些病例可進(jìn)一步分為腺癌(40%)、鱗狀細(xì)胞癌(30%～35%)和大細(xì)胞癌(5%～15%)[2]。大多數(shù)晚期腺癌的患者5年生存率只有5%～20%[3]。肺癌的治療方法包括手術(shù)、放療和化療，近年來，分子靶向治療在晚期肺癌的治療過程中發(fā)揮越來越大的作用，但由于不同個(gè)體的基因背景的差異，肺癌的診療仍然面臨很多技術(shù)性難題[4]。

microRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，主要通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[5]。miRNAs是細(xì)胞生物學(xué)中重要的調(diào)控因子，調(diào)控靶基因的表達(dá)，可被視為細(xì)胞通訊的一部分[6]。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌患者的miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，采用R語言程序包——limma包，篩選miRNAs表達(dá)譜終端差異表達(dá)的miRNAs，旨在探討這些miRNAs與肺腺癌臨床參數(shù)的關(guān)系以及與肺腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與初步分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫獲取miRNAs表達(dá)譜數(shù)據(jù)及患者的臨床資料，病例均為經(jīng)病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性肺腺癌且術(shù)前未經(jīng)過任何治療；具備完整的臨床分期資料和預(yù)后相關(guān)信息；表達(dá)譜數(shù)據(jù)基于肺腺癌患者癌組織和癌旁組織。

合計(jì)518例肺腺癌納入分析，其中女性樣本276例，年齡39～87歲，平均年齡(65±10)歲；男性樣本242例，年齡38～88 歲，平均年齡(65±9.7)歲，一般資料見表1。納入研究的病例在年齡、性別等方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

表1 518例肺腺癌患者的臨床特點(diǎn)

1.2 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用limma包處理miRNAs表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，篩選差異表達(dá)的miRNAs。以P<0.01且log2|差異倍數(shù)(FC)|≥1為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 篩選與預(yù)后相關(guān)的miRNAs

對篩選出的多個(gè)差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行分組，基于每個(gè)miRNA的表達(dá)量分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。采取Kaplan-Meier生存曲線分析低表達(dá)和高表達(dá)的miRNA與總體生存期(OS)的相關(guān)性，獲得與總體生存期顯著相關(guān)的miRNAs。進(jìn)一步應(yīng)用單因素和多因素Cox回歸模型分析與OS相關(guān)的miRNAs，獲取風(fēng)險(xiǎn)比值(HR)。

1.4 差異表達(dá)miRNAs與臨床參數(shù)的相關(guān)性

基于肺腺癌患者年齡、總體生存狀態(tài)以及TNM分期進(jìn)行分組，分析與OS相關(guān)的miRNAs與各臨床參數(shù)的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用R程序包(limma包和survival包)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示；生存分析采用Kaplan-Meier曲線；Log-Rank方法檢驗(yàn)miRNA低表達(dá)和高表達(dá)組生存率差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型， miRNA表達(dá)量和臨床參數(shù)之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)miRNAs的篩選

篩選出基于癌組織與癌旁組織差異表達(dá)的miRNAs共計(jì)125個(gè)，其中95個(gè)上調(diào)miRNA，30個(gè)下調(diào)miRNAs。肺腺癌患者表達(dá)譜數(shù)據(jù)差異表達(dá)miRNAs分布情況見圖1。

注：pvalue表示p值;FC表示差異倍數(shù)；棕色表示上調(diào)miRNAs，藍(lán)色表示下調(diào)miRNAs

2.2 與OS相關(guān)的miRNAs篩選

基于每個(gè)miRNA的表達(dá)中值，將其分成高表達(dá)組和低表達(dá)組。以Kaplan-Meier生存曲線和Log-Rank檢驗(yàn)方法分析125個(gè)差異表達(dá)的miRNAs和肺腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果顯示，hsa-mir-9-2(P=0.020)、hsa-mir-9-1(P=0.028)、hsa-mir-9-3(P=0.020)、hsa-let-7c(P=0.025)、hsa-mir-29b-2(P=0.044)、hsa-mir-490(P=0.031)、hsa-mir-548v(P=0.001)和hsa-mir-375(P=0.038)與肺腺癌患者的預(yù)后呈顯著相關(guān)。其中高表達(dá)hsa-mir-9-2、hsa-mir-9-1和hsa-mir-9-3與預(yù)后差顯著相關(guān)，而低表達(dá)hsa-let-7c、hsa-mir-29b-2、hsa-mir-490、hsa-mir-548v和hsa-mir-375與預(yù)后差呈顯著相關(guān)。見圖2。

圖2 與預(yù)后顯著相關(guān)的miRNAs的生存曲線

單因素和多因素Cox回歸分析驗(yàn)證結(jié)果顯示，肺腺癌患者的預(yù)后與差異表達(dá)的miRNAs具有相關(guān)性，高表達(dá)hsa-mir-9-2(P=0.020)、hsa-mir-9-1(P=0.028)和hsa-mir-9-3(P=0.020)和低表達(dá)hsa-let-7c(P=0.025)、hsa-mir-29b-2(P=0.044)、hsa-mir-490(P=0.031)、hsa-mir-548v(P=0.001)和hsa-mir-375(P=0.038)是肺腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)后因素。見表2。

表2 肺腺癌患者差異表達(dá)miRNAs的Cox回歸分析

3 討 論

microRNA是內(nèi)源性基因編碼的長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA，大約一半(52%)的人類microRNA位于基因間區(qū)域，40%位于基因的內(nèi)含子區(qū)域，8%位于外顯子，microRNA積極參與各種抑癌基因和癌基因的調(diào)控，miRNA對基因表達(dá)的調(diào)控作用很大程度上是通過降解目標(biāo)mRNA或干擾目標(biāo)mRNA的翻譯介導(dǎo)的[6]。研究證實(shí)，非編碼RNA在肺腺癌進(jìn)展中的發(fā)揮著關(guān)鍵作用。非編碼RNA可能成為肺癌的早期生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。因此，靶向非編碼RNAs可能是開發(fā)針對肺癌的新療法并克服化學(xué)耐藥性的有效方法[7]。

Ren等[5]認(rèn)為，hsa-mir-486-1、hsa-mir-486-2、hsa-mir-153、hsa-mir-210、hsa-mir-9-1、hsa-mir-9-2、hsa-mir-9-3、hsa-mir-577和hsa-mir-4732可作為診斷肺腺癌的特異性生物標(biāo)志物。Lin等[8]認(rèn)為，miR-548v高表達(dá)組的生存時(shí)間低于miR-548v低表達(dá)組的生存時(shí)間。在TCGA和GBM患者隊(duì)列中，神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的miR-490表達(dá)明顯下調(diào)[9]，SP1被證實(shí)是miR-490的靶標(biāo)，敲低SP1可以逆轉(zhuǎn)miR-490抑癌作用[10]。相關(guān)研究也表明，miR-21、miR-99B和miR-375可作為晚期直腸癌對于放化療的敏感性的預(yù)測指標(biāo)，從而減少放化療對放化療無反應(yīng)性腫瘤患者的毒性不良反應(yīng)[11]。miR-375可以有效抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的SLC7A11水平而發(fā)揮抑癌作用[12]。miR-29b-2-5p在體內(nèi)和體外能抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，還通過靶向Cbl-b促p53表達(dá)來改善PDAC的預(yù)后，且將構(gòu)成PDAC中的重要預(yù)后因素[13]。Glypican-3(GPC3)作為一種致癌基因，在肝惡性腫瘤(如肝細(xì)胞癌、肝母細(xì)胞瘤)中經(jīng)常上調(diào)，且構(gòu)成治療肝癌的潛在分子靶標(biāo)，miR-548v則可降低致癌基因GPC3的表達(dá)[14]。另外，let-7c也可能是潛在的乳腺癌治療靶標(biāo)[15]。

本研究對TCGA中肺腺癌患者miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，篩選得到與肺腺癌預(yù)后顯著相關(guān)的miRNAs有8個(gè)，hsa-mir-9-2、hsa-mir-9-1、hsa-mir-9-3、hsa-let-7c、hsa-mir-29b-2、hsa-mir-490、hsa-mir-548v和hsa-mir-375，其中高表達(dá)hsa-mir-9-2、hsa-mir-9-1和hsa-mir-9-3與預(yù)后差顯著相關(guān)，而低表達(dá)hsa-let-7c、hsa-mir-29b-2、hsa-mir-490、hsa-mir-548v和hsa-mir-375與預(yù)后差顯著相關(guān)。綜上所述，部分miRNAs與肺腺癌的臨床參數(shù)和預(yù)后存在顯著相關(guān)性，可為為尋找肺腺癌新的診斷和預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物以及個(gè)性化治療提供新思路。