奉俊敏，李少明*，鄺素軍，郭 偉

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，2.急診科，廣東 廣州 510120)

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是致殘率、死亡率極高的腦血管疾病。腦出血后繼發(fā)腦水腫，尤其是血管源性腦水腫被認(rèn)為是出血后損傷的中心環(huán)節(jié)，是導(dǎo)致患者病情加重和死亡的主要原因之一[1]，但血腫周圍腦水腫形成的病理生理機(jī)制尚不清楚。有研究表明，腦出血后血腫周圍炎癥損傷是造成腦水腫的直接原因[2]。TLR4屬于跨膜炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，可加劇炎性損傷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TLR4是腦出血后炎癥反應(yīng)的重要參與者[3，4]。但TLR4是否通過介導(dǎo)炎性反應(yīng)，參與腦出血后腦水腫形成，還有待實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本研究采用自體動(dòng)脈血注入法建立大鼠腦出血模型，觀察血腫周圍TLR4的動(dòng)態(tài)表達(dá)與腦水腫的相關(guān)性，為進(jìn)一步探索TLR4在腦出血后血腫周圍腦水腫形成中的炎癥損傷機(jī)制奠定初步基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量250～300 g，購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物頭顱立體定向儀(美國(guó)Stoelting公司)；電子分析天平(上海天平儀器廠)；免疫組化抗體試劑(美國(guó)Abcam公司)；202A-1 型電熱恒溫干燥箱(上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1模型制備 10%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)麻醉(劑量為4 μl/g)，大鼠俯臥位，頭頂正中縱行切開，顱骨前囟前0.2 mm、中線右側(cè)旁3 mm處鉆一個(gè)直徑為1.5 mm圓孔，深達(dá)硬腦膜表面。將微量進(jìn)樣器沿鉆孔垂直進(jìn)針約6 mm直至靶點(diǎn)。手術(shù)組將自體新鮮非抗凝動(dòng)脈血50 μL 20 min內(nèi)緩慢推注入腦(相當(dāng)于尾狀核的位置)，假手術(shù)組將生理鹽水50 μL 20 min內(nèi)緩慢推注入腦，留置10 min后緩慢拔針。各組動(dòng)物屆時(shí)斷頭處死，處死前進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定。

1.2.2動(dòng)物分組 將大鼠隨機(jī)分為手術(shù)組和假手術(shù)組，每組60只。術(shù)后1、6 h，1、3、5、7 d各取10只大鼠腦組織，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.2.3測(cè)量腦水腫腦組織含水量 于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)斷頭處死動(dòng)物5只，采用干濕重法測(cè)量含水量。取每只大鼠右側(cè)大腦半球腦組織稱重(濕重)，置入80℃恒溫烤箱中，24 h后取出再稱重(干重)。腦組織含水量={(濕重-干重)/濕重}×100%。

1.2.4免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)TLR4、TNF-α表達(dá)

1.2.4.1取材和切片 于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取動(dòng)物5只，10%水合氯醛麻醉后，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液灌注后斷頭取腦，石蠟包埋，切片后行HE染色、免疫組織化學(xué)分析。

1.2.4.2SP法免疫組化染色 對(duì)切片進(jìn)行脫蠟、水化后，在PBS液中洗2～3次，每次5 min；滴加3% H2O2在TMA上面，室溫下放置10 min后，以PBS液沖洗2～3次，每次5 min；加入山羊血清封閉液，于室溫下靜置20 min，小心吸去多余液體，滴加各檢測(cè)指標(biāo)稀釋好的一抗50 μL，37 ℃下放置1 h；PBS沖洗3次，每次2 min；滴加稀釋好的二抗50 μL，37 ℃下放置1 h，PBS液沖洗3次，每次5 min；DAB顯色5～10 min，PBS沖洗10 min；蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸酒精中分化，自來水沖洗10～15 min，脫水、透明、封片，鏡檢拍照。

1.2.5免疫組織化學(xué)結(jié)果計(jì)數(shù)分析 血腫邊緣的TLR4、TNF-α陽性細(xì)胞采用隨機(jī)視野雙盲評(píng)分。

2 結(jié) 果

2.1 腦組織含水量

手術(shù)組大鼠ICH后腦組織含水量從6 h開始逐漸升高，至第3天時(shí)含水量達(dá)到最高峰，第1天、第3天與手術(shù)前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；隨后開始下降，第5天、第7天相對(duì)于第3天降低(P<0.01)；非手術(shù)組各時(shí)相點(diǎn)變化無明顯差異(P>0.05)。見圖1。

注：與1 h相比，*P<0.01；與3 d相比，#P<0.01

2.2 ICH 后TLR4、TNF-α在冠狀腦細(xì)胞上的動(dòng)態(tài)表達(dá)

同假手術(shù)組相比，手術(shù)組在腦出血后6 h，1、3、5、7 d的TLR4陽性細(xì)胞百分比均增高(P<0.05)，且TLR4的表達(dá)于6 h開始增多，3 d達(dá)高峰，5 d時(shí)有所下降。見表1，圖2。

表1 兩組各時(shí)相點(diǎn)血腫周圍TLR4陽性細(xì)胞百分比比較(n=5)

6h1h1d3d7d5d

與假手術(shù)組相比，手術(shù)組在腦出血后1、3、5、7 d的TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)百分比均增高(P<0.05)，TNF-α表達(dá)于1 d時(shí)開始增多，3 d達(dá)高峰，5 d時(shí)開始下降。見表2，圖3。

2.3 手術(shù)組TLR4 表達(dá)與大鼠腦水腫腦組織含水量相關(guān)性

手術(shù)組大鼠TLR4表達(dá)與腦水腫腦組織含水量呈直線正相關(guān)(r2=0.973，P<0.05 )。

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05

3 討 論

腦出血后繼發(fā)性損傷腦水腫形成是多種機(jī)制的綜合結(jié)果，其中炎性損傷機(jī)制備受矚目[5,6]，各種炎性細(xì)胞的激活，細(xì)胞因子、炎性遞質(zhì)的釋放，共同造成或加重繼發(fā)性腦損傷[7]。

目前，在炎癥免疫反應(yīng)的研究領(lǐng)域里，Toll樣受體家族(Toll-like Receptors, TLRs)是眾多學(xué)者的關(guān)注熱點(diǎn)，其屬于跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體家族，通過感知病原微生物存在，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的炎性信號(hào)。Toll樣受體4(Toll-like Receptor4, TLR4)介導(dǎo)細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，其發(fā)現(xiàn)被稱為是感染性疾病炎癥免疫機(jī)制研究的重要里程碑。LR4還可介導(dǎo)非感染性炎性損傷[8-9]。TLR4豐富表達(dá)于外周血單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是表達(dá)TLR4的主要細(xì)胞[10]，尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞[11，12]。大量動(dòng)物模型試驗(yàn)表明，腦出血后血腫周圍腦組織中TLR4表達(dá)上調(diào)[13-14]，并且在高血壓腦出血患者活體腦組織中也得到證實(shí)[15]。

本研究結(jié)果顯示，腦出血后TLR4 表達(dá)明顯高于對(duì)照組;且TLR4表達(dá)于6 h開始增多，3 d達(dá)高峰，5、7 d時(shí)有所下降，這與眾多報(bào)道一致。同時(shí)，本研究結(jié)果還表明，TNF-α表達(dá)于1 d時(shí)開始增多，3 d達(dá)高峰，5 d時(shí)開始下降。TLR4表達(dá)上升時(shí)間略早于TNF-α，3 d時(shí)同時(shí)達(dá)到高峰，并在5、7 d略下調(diào)，但仍維持于相對(duì)較高的水平。TLR4與TNF-α在時(shí)間上高度的同步性，提示兩者之間存在著緊密關(guān)聯(lián)性。此外，隨時(shí)間變化，TLR4表達(dá)相對(duì)倍數(shù)明顯增高，于72 h 達(dá)高峰；大鼠ICH后腦水腫水含量從6 h開始逐漸升高，至第3天時(shí)含水量達(dá)到最高峰，二者呈直線正相關(guān)，這提示腦出血后腦組織TLR4 的表達(dá)與血腫周圍腦水腫明顯相關(guān)。由于TLR4作為跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，可誘導(dǎo)MyD88依賴和非MyD88依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終激活核因子-κB(NF-κB)和c-Jun，活化炎癥細(xì)胞，從而誘發(fā)細(xì)胞因子和組織因子、黏附分子等的大量釋放，形成瀑布式的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，加劇炎性損傷；TNF-α作為參與腦出血后損傷的重要炎性因子之一，據(jù)此，我們推測(cè)TLR4通過介導(dǎo)炎性機(jī)制參與了腦出血后血腫周圍腦水腫形成，導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損加重。

值得注意的是，有研究表明，血紅素(Heme)可通過單核巨噬細(xì)胞表達(dá)的TLR4 誘發(fā)炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生大量炎癥因子導(dǎo)致組織損傷[16]，Heme/TLR4途徑是導(dǎo)致高血壓腦出血后炎癥損傷的啟動(dòng)環(huán)節(jié)[17]，今后進(jìn)一步探索TLR4在腦出血后繼發(fā)性損傷腦水腫形成的作用機(jī)制，將為臨床有效抑制腦出血后腦水腫提供治療靶點(diǎn)。