廖東江,盧心鵬，冼慧儀

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 廣州呼吸健康研究院 呼吸疾病國家重點實驗室 國家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510120；2.廣東工業(yè)大學(xué)，廣東 廣州 510520)

肺動脈高壓(Pulmonary Hypertension，PH)是一種罹患致死性疾病。最新研究表明，其患病率約占人群中4.3%[1]。近年來隨著靶向藥物的廣泛應(yīng)用，肺動脈高壓患者生存預(yù)后得到一定程度上的改善，但仍不十分理想。國外一項肺動脈高壓登記注冊研究表明，肺動脈高壓患者1年、3年、5年、7年生存率分別為91%、85%、68%、49%[2]。因此深入研究其發(fā)病機(jī)制及新型靶向藥物亟不可待。

動物模型是我們研究疾病的發(fā)病機(jī)制及藥物研發(fā)的重要工具。目前肺動脈高壓的動物模型多以慢性為主，包括自發(fā)性、MCT誘導(dǎo)性、低氧性、肺高血流性、栓塞性、雙重打擊性[3]。急性肺動脈高壓動物模型最早報道于1971年[4]，目前大多數(shù)采用大型動物如羊、豬等制備，但由于麻醉難度大、動物飼養(yǎng)場地要求高、成本高昂等原因難以推廣。近年來也有越來越多學(xué)者嘗試使用大鼠制備急性肺動脈高壓(acute pulmonary hypertension,APH)模型，但效果并不好[5,6]。因此，本研究旨在建立簡便、易于復(fù)制的急性肺動脈高壓大鼠模型，為肺動脈高壓的發(fā)病機(jī)制及靶向藥物的開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級雄性SD大鼠12只(180 g～200 g)，由廣東省實驗動物中心提供(許可證號：SCXK(粵)2018-0002)，完全隨機(jī)分為模型組及模型+曲前列尼爾組。

1.2 主要試劑與儀器

U46619 -血栓烷A2(thromboxane A2，TxA2)的類似物購于美國Cayman公司，曲前列尼爾注射液購于中國李氏大藥廠公司，Powerlab(8通道)、Labchart pro、生理壓力換能器、血壓放大器、動物生理放大器均購于澳大利亞AD instrument公司。

1.3 急性肺動脈高壓大鼠模型的建立

大鼠采用戊巴比妥鈉麻醉，首次麻醉劑量為50 mg/kg，90 min后根據(jù)大鼠呼吸頻率和痛覺刺激調(diào)整麻醉藥物：若呼吸頻率大于75 次/分鐘，大鼠腳板壓痛反射可引出，補(bǔ)充15 mg/kg的戊巴比妥鈉。麻醉平穩(wěn)后，觀察大鼠呼吸情況，大鼠呼吸頻率在60-75 次/分鐘為宜。將兩根20 cm長PE10管，置于大鼠左右兩側(cè)尾靜脈。將兩根PE10管固定后，開始注射生理鹽水(0.5 ml/h)，用于補(bǔ)充手術(shù)中的體液損失。電極針分別插入大鼠的雙上肢和右下肢皮下，工作電極正極(紅色)于右上肢，參比電極負(fù)極(綠色)于左下肢，參比電極右下肢(黑色電極)。測定基礎(chǔ)值右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure， RASP)及心率后，兩組大鼠分別用于連續(xù)注射U46619 (劑量在(150-300)ng/kg/min調(diào)整，維持RVSP在35 mm Hg左右)， 10 min后RVSP開始升高，RVSP持續(xù)升高10 min后分別予生理鹽水、曲前列尼爾(100 ng/kg/min)持續(xù)注射。實驗過程持續(xù)監(jiān)測兩組RVSP及心率。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠右心室收縮壓變化情況

模型組及模型+曲前列尼爾組基礎(chǔ)RASP分別為(25.68±3.92)mm Hg、(24.11±7.11)mm Hg，兩組間基礎(chǔ)RVSP無顯著差別(t=0.464，P=0.654，n=6)(圖1)。注射U46619后兩組RVSP分別上升至(38.72±5.16)mm Hg、(38.39±4.05)mm Hg，分別與兩組基礎(chǔ)值比較，RVSP顯著升高，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-4.928，t=-3.90；P=0.01，P=0.05；n=6)。持續(xù)注射U46619 20 min后，模型組、模型+曲前列尼爾組分別持續(xù)予生理鹽水、曲前列尼爾注射。曲前列尼爾持續(xù)注射17分鐘后，大鼠RVSP下降至(31.48±5.13)mm Hg，較使用曲前列尼爾前RVSP顯著下降(t=2.437，P=0.035，n=6)。

注：Model代表模型組，Treprostinil代表模型+曲前列尼爾組。

2.2 大鼠心率變化情況

與模型組(305.84±35.98)bpm相比，模型+曲前列尼爾組基礎(chǔ)心率(351.30±43.59)bpm，兩組間無顯著差別(t=﹣1.898，P=0.09，n=6)(圖2)。與基礎(chǔ)心率相比，持續(xù)注射U46619后兩組心率分別為(285.57±41.19)bpm和(348.14±36.79)bpm 無顯著增加(t=1.11，t=-0.554；P=0.30，P=0.59；n=6)。另外，曲前列尼爾持續(xù)注射17分鐘后，模型+曲前列尼爾組的心率為(336.11±47.68)bpm，與注射曲前列尼爾前無明顯差別(t=0.489，P=0.64，n=6)。

注：Model代表模型組，Treprostinil代表模型+曲前列尼爾組

3 討 論

U46619 是TxA2的類似物，它可以激活蛋白激酶C相關(guān)激酶(protein kinase C-related kinase，PRK) 催化磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate，PIP2)轉(zhuǎn)化為三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)。隨后IP3與內(nèi)質(zhì)膜或液泡膜上的IP3-閘門Ca2+通道結(jié)合，使Ca2+通道打開，引起Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度高；IP3還可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣庫的釋放，進(jìn)一步增加胞質(zhì)Ca2+的濃度。研究證實U46619可通過上調(diào)動脈平滑肌細(xì)胞中鈣離子濃度，可以引起離體肺動脈[7-9]、海綿體陰莖動脈[10]、腸系膜動脈[10]的急性收縮。此外，利用U46619研究者還建立了豬[11-16]、羊[17-20]、犬[21-24]、兔[25-27]的急性肺動脈高壓動物模型。

曲良超等利用雙心房輸注前列腺素E1和去氧腎上腺素構(gòu)建了犬APH模型[28]；陳洪茂等[29]、李娟等[30]、吳文振等[31]通過從股靜脈注射自體血栓的方法建立了兔、犬 APH模型；徐卓明等[32]、夏紅萍等[33]成功建立低氧誘導(dǎo)的幼豬APH模型。這些急性肺動脈高壓模型主要使用大型動物建立，但大型動物對麻醉、飼養(yǎng)和實驗場地、費用均要求較高，不利于推廣。自體血栓構(gòu)建的APH動物模型亦有缺點：個體差異大、結(jié)果重復(fù)性較差、肺動脈壓力難以達(dá)到一個穩(wěn)定狀態(tài)。缺氧誘導(dǎo)的APH，對設(shè)備、場地要求高，肺動脈壓力同樣不能達(dá)到一個較為穩(wěn)定的狀態(tài)，這些缺點限制了該模型的應(yīng)用。最近學(xué)者嘗試通過低氧[34]、肺動脈結(jié)扎[5]、U46619聯(lián)合L-硝基精氨酸甲酯(L-N-nitro-arginine methylester,L-NAME)[6]建立急性肺動脈高壓大鼠模型，但是方法繁瑣，成功率不高。為了建立一個易于復(fù)制、簡便的APH模型，我們通過在大鼠體內(nèi)靜脈連續(xù)注射U46619，結(jié)果顯示我們成功誘導(dǎo)出APH大鼠模型，且模型組心率在肺動脈壓力升高過程中無明顯波動。

曲前列尼爾,是一種穩(wěn)定的前列環(huán)素類似物，用于治療PAH。該化合物可以激動前列環(huán)素信號通路，舒張平滑肌，抑制血小板聚集及平滑肌細(xì)胞增生，具有良好的療效和安全性。曲前列尼爾在不同類型肺動脈高壓患者的應(yīng)用已被廣泛認(rèn)可[35-38]。為了證實APH大鼠模型的肺動脈壓力的可逆性，在U46619誘導(dǎo)的肺動脈動脈壓力升高后，我們予持續(xù)曲前列尼爾注射，17 min后肺動脈壓力明顯下降。這提示APH大鼠模型肺動脈壓力可逆，對靶向藥物篩選具有十分重要意義。

綜上所述，用U46619持續(xù)靜脈注射法可以有效建立一種APH大鼠模型，且步驟簡單，成功率高。模型組大鼠右心室壓力升高明顯、符合PH血流動力學(xué)特點。該模型將為PH的發(fā)病機(jī)制及研究血管收縮相關(guān)靶向藥物研發(fā)等提供一定的實驗依據(jù)。