劉 佳，黃思洋，陳鈺沁，朱艷玲，趙明智，付娟姬，楊伶俐

(1.昆明醫(yī)科大學(xué) 海源學(xué)院，云南 昆明 650101；2．昆藥集團(tuán)血塞通藥業(yè)股份有限公司，云南 文山 663400； 3．昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 科教部，云南 昆明 650000)

大黃(RheumoffcinaleBaill.)的莖、根除去雜質(zhì)及外皮，切碎，進(jìn)行干燥后即可藥用.大黃有較多的藥理作用，富含蒽醌類、蒽酮類、總鞣質(zhì)等化學(xué)成分，具有良好的致瀉、止痛、抗腫瘤、抗衰老、解毒等功效，常用于臨床治療[1-2].

許多學(xué)者[1-4]對(duì)大黃的研究主要集中于蒽醌類化合物，因蒽醌類化合物具有一定的抗菌活性，并有致瀉作用.而鞣質(zhì)是大黃中重要的活性成分之一，別名單寧，相對(duì)分子質(zhì)量為500～3 000，主要分為水解型和縮合型，其中沒食子酸和d-兒茶素是鞣質(zhì)的主要單體成分，具有一定的藥理活性[5-6].此外，鞣質(zhì)是一類結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的多元酚類化合物，在植物界分布廣泛，約70%以上的生藥中含有鞣質(zhì)類化合物[7].研究[8]發(fā)現(xiàn)，鞣質(zhì)化合物數(shù)量多、類型廣，具有廣泛的藥理活性.據(jù)報(bào)道[7,9-13]，鞣質(zhì)具有抗心腦血管疾病、抗高血壓、降血脂、降血糖等作用.

鞣質(zhì)的提取方法主要有超聲波輔助提取、微波提取、浸漬法、水煎法、加壓提取和超臨界流體萃取等，其中：水煎法也稱為煎煮法，是一種常見的浸提方法，該方法方便且經(jīng)濟(jì)，但對(duì)于煎煮時(shí)間、浸泡時(shí)間等沒有一個(gè)最佳標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致提取的有效成分效果不明顯，且雜質(zhì)較多，水煎液易變質(zhì)[14].浸漬法是在容器中裝入生藥粗粉，再利用溶劑(如水和乙醇等)浸漬藥材使其活性成分得到溶解.該方法特別適用于提取有效成分易破壞的藥材、黏性藥材、芳香性藥材和非結(jié)構(gòu)化醫(yī)藥產(chǎn)品.此外，浸漬法根據(jù)提取溫度分為熱、溫、冷3種方法，按浸漬次數(shù)又分為輕和重2種方法.由于該方法操作時(shí)間長(zhǎng)，且很難完全浸漬出活性成分，因此對(duì)于價(jià)值高的藥材、毒性藥材等都不宜采用此方法.而超聲波輔助提取法是借助超聲波從植物中提取活性成分，其原理是破壞細(xì)胞膜，用超聲波來連續(xù)震蕩提取物，使活性成分得到溶解并釋放出來，同時(shí)產(chǎn)生熱量以保持水溫，使原料被水溶解.超聲波輔助提取法可縮短提取時(shí)間，提高活性成分的提取率及原料的使用率.因此，本研究擬采用超聲波輔助提取法提取大黃中的總鞣質(zhì)，并通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)提取方法進(jìn)行探討，以期篩選出提取大黃中總鞣質(zhì)的最佳方法.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

UV2550紫外可見光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司)；SI204型電子天平(上海贊維衡器有限公司)；AG133型電子天平(深圳市盛美儀器有限公司)；SHBIII循環(huán)水式多用真空泵(鄭州科秦實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；SK2200H超聲儀(蘇州創(chuàng)惠電子有限公司)；Direct-QTM5超純水儀(上海礫鼎水處理設(shè)備有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(FANAI儀器有限公司)；101A3型干燥箱(上海榮計(jì)達(dá)儀器科技有限公司)；JZL型中藥粉碎機(jī)(廣州市賽豪機(jī)械有限公司).

1.2 試藥和樣品

大黃藥材(購(gòu)自北京同仁堂西安市西大街店)；沒食子酸對(duì)照品(上海鼓臣生物技術(shù)有限公司)；無水碳酸鈉、干酪素、乙醇(分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取工藝

稱取一定量的大黃藥材，粉碎后過篩，再精密稱取10.00 g的大黃粉末，放入10 mL容量瓶中，并加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，超聲提取60 min，并用乙醇補(bǔ)足，靜置過夜，取上清液，得到質(zhì)量濃度為1 g/mL的生藥.

1.3.2 供試品溶液制備

量取1.3.1項(xiàng)下的適量大黃提取液至250 mL的棕色容量瓶中，并加體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇 150 mL，靜置過夜，超聲處理10 min，冷卻并加乙醇稀釋至刻度，輕輕搖動(dòng)容量瓶，使其混合均勻.充分靜置后過濾，棄初濾液，精密量取10 mL置于100 mL的容量瓶中，再加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，輕輕搖晃容量瓶，讓其均勻混合，得供試品溶液.

1.3.3 對(duì)照品溶液制備

精密稱取50 mg的沒石子酸對(duì)照品,然后置于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度.精密量取該溶液5 mL置于50 mL的棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得.

1.3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

取適量的沒食子酸對(duì)照品置于50 mL的棕色瓶中，加入1 mL的磷鉬鎢酸試液及20 mL的水，最后用29%碳酸鈉溶液定容至刻度，放置陰涼處?kù)o置15 min，選擇體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液作為參照物，掃描波長(zhǎng)范圍選定在200～800 nm處，得最大吸收波長(zhǎng)為760 nm.

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

分別精密量取1.3.3項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置于6個(gè) 25 mL 的棕色容量瓶中，然后順次加入1 mL的磷鉬鎢酸試液，并分別加入11.5，11.0，10.0，9.0，8.0，7.0 mL的水，再用29%碳酸鈉溶液定容至刻度，輕輕搖晃容量瓶，使其混合均勻，最后靜置15 min.用空白溶液作參比溶液，測(cè)定 760 nm 處的吸光度值.以吸光度值為縱坐標(biāo)，溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3.6 總鞣質(zhì)含量的測(cè)定

1)總酚含量的測(cè)定.將4.0 mL供試品溶液倒進(jìn)50 mL潔凈的棕色量瓶中，采用與1.3.2項(xiàng)下相同方法則可得到各種供試品溶液，在760 nm處測(cè)定吸光度值，將吸光度值代人回歸方程，通過計(jì)算即可得到溶液里的總酚含量.

2)不被吸附多酚含量的測(cè)定.在100 mL錐形瓶中加入0.6 g磨成細(xì)粉的干酪素和25 mL于1.3.2項(xiàng)下所制備的溶液放入30 ℃恒溫水浴鍋中 1 h，搖勻，水浴保溫后拿出，放冷至室溫，混合均勻靜置，過濾棄初濾液，精密量取4 mL續(xù)濾液，倒入50 mL潔凈的棕色量瓶中，使用1.3.4項(xiàng)下方式處理，于 760 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，代入回歸方程式，通過計(jì)算即可得到不被吸附的多酚含量.

3)總鞣質(zhì)含量為：總鞣質(zhì)含量=總酚含量-不被吸附的多酚含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度考察

精密量取沒食子酸對(duì)照品溶液，于760 nm波長(zhǎng)處，連續(xù)6次測(cè)定吸光度值.通過計(jì)算得到RSD為0.263%，表明儀器的精密度良好.

2.1.2 穩(wěn)定性考察

取1.3.2項(xiàng)下制備的供試品溶液6份，在 760 nm 波長(zhǎng)處，于0，1，2，4，8，12，24 h分別測(cè)定吸光度值.通過計(jì)算得到RSD為0.216%，表明在24 h內(nèi)，該樣品穩(wěn)定性良好.

2.1.3 重復(fù)性考察

取6個(gè)樣品，按1.3.2項(xiàng)下制備的供試品溶液，在波長(zhǎng)760 nm處測(cè)定吸收度值.通過計(jì)算得到RSD為0.132%，表明重復(fù)性良好.

2.1.4 線性關(guān)系考察

根據(jù)數(shù)據(jù)繪制工作曲線，橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)分別為沒食子酸質(zhì)量濃度(mg/mL)和吸光度值(A)，得到回歸方程，Y=98.959x-0.011 3(R2=0.999 6)，詳見圖1.

圖1 沒食子酸工作曲線

2.1.5 加樣回收率

精密稱取9份已知樣品各0.1 g，并分別加入相同質(zhì)量的沒食子酸對(duì)照品.根據(jù)1.3.2項(xiàng)下制備的供試品溶液，在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，并計(jì)算回收率，得到平均回收率為99.13%，RSD為0.398%，回收率比較高，詳見表1.

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)考察

2.2.1 溶劑體積分?jǐn)?shù)篩選

取5份各8 g的大黃粉末，精密稱定.然后分別加入15倍量體積分?jǐn)?shù)為20%，40%，60%，80%，100%的乙醇，超聲提取60 min.顯色后在波長(zhǎng)760 nm處測(cè)定吸光度值,結(jié)果見表2.

2.2.2 提取時(shí)間篩選

分別取5份各8 g的大黃粉末，精密稱定.然后再加入15倍量體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，分別超聲提取20，40，60，80，100 min.顯色后在波長(zhǎng)760 nm處測(cè)定其吸光度值，提取時(shí)間篩選結(jié)果見表3.

表2 溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)總鞣質(zhì)提取率的影響

表3 提取時(shí)間對(duì)總鞣質(zhì)提取率的影響

2.2.3 固液比篩選

取5份各8 g的大黃粉末，精密稱定.加入5，10，15，20，25倍體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，超聲提取80 min.顯色后在波長(zhǎng)760 nm處測(cè)定吸光度值，結(jié)果見表4.

2.2.4 正交實(shí)驗(yàn)

將單因素實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，完成正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，詳見表5.在實(shí)驗(yàn)過程中將其提取率作為指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，共進(jìn)行3次，然后對(duì)3次測(cè)定的數(shù)值進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表6[15].

通過極差分析比較，在上述影響因素中，對(duì)提取率影響最大的為A，其次為C，影響率最小的是B.因此,最優(yōu)提取工藝為A2B3C1，換言之，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、提取時(shí)間為 100 min、溶劑用量為15倍時(shí)，大黃中總鞣質(zhì)的提取率最高.

表4 固液比對(duì)總鞣質(zhì)提取率的影響

表5 因素水平表(n=3)

表6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了對(duì)提取工藝的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證，使用相同的提取工藝，按照樣品制備方法平行制備3 份樣品，則得到平均提取率為1.395%，說明本提取工藝穩(wěn)定、可靠，可用于大黃中總鞣質(zhì)的提取.

3 小結(jié)

本研究使用乙醇為溶劑，并采用超聲波輔助提取法提取大黃中的總鞣質(zhì)，該方法相較使用溶劑為水的煎煮法、浸漬法、滲漏法等提取方法而言，不僅提取效率明顯高于其他方法，而且對(duì)有效成分的結(jié)構(gòu)破壞較小，可避免蒽醌類衍生物由于熱不穩(wěn)定性而增加溶出物被破壞的可能性[16-18].

本研究著重對(duì)大黃中總鞣質(zhì)的提取方法進(jìn)行了探討，并通過單因素實(shí)驗(yàn)探究了溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和溶劑用量3個(gè)主要因素對(duì)于產(chǎn)物提取率的影響，結(jié)果表明，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、提取時(shí)間為100 min、溶劑用量為15倍時(shí)，大黃中總鞣質(zhì)的提取率最高.