肖 涵，侯 順

(昆明學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昆明 650214)

在自然條件下，茶樹(shù)全年經(jīng)歷3次生長(zhǎng)-休止輪替，于冬季休眠.目前，對(duì)茶樹(shù)季節(jié)輪替變化的研究多基于行業(yè)習(xí)慣，并關(guān)注春夏秋3季[1-3]，而有關(guān)茶樹(shù)越冬期的研究尚不多見(jiàn).研究[4-6]表明，生長(zhǎng)周期的變化主要體現(xiàn)在日照、積溫、水分含量的變化，導(dǎo)致茶樹(shù)對(duì)多種元素的吸收分布出現(xiàn)差異，Na、Mg、K、V、Cr、Co、Rb、Pt、Se、Ce和Y可以作為不同季節(jié)茶葉的指紋因子.物候變化也干擾葉片次生代謝產(chǎn)物，特別是滲透性調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖等[7-8].低溫導(dǎo)致茶樹(shù)抗凍耐冬機(jī)制啟動(dòng)，并參與生長(zhǎng)、發(fā)育、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞分裂的代謝組變化[9]，使SOD/APX/GR等多種同工酶活性下降[10]，以及代謝率大大降低；低溫干燥促使茶多糖蓄積為其他季節(jié)的2～3倍，酯型兒茶素含量下降，低聚糖類(lèi)分解為棉子糖、葡萄糖和果糖[11].此外，以上特殊周期變化使冬茶耐泡性提高、滋味醇厚、回甘升高、苦澀感下降，呈現(xiàn)蔗糖甜與花果香，后期轉(zhuǎn)化表現(xiàn)良好.受物候影響，目前我國(guó)只有福建、皖南、岳西、貴州和云南鳳慶有冬茶出產(chǎn)史，普洱近期也開(kāi)始研制冬紅茶.

云南省臨滄市鳳慶縣屬滇紅茶代表性產(chǎn)區(qū).鳳慶大葉種茶樹(shù)(Camelliasinensis(Linn.) var.assamica(Masters) Kitamura)種植時(shí)間長(zhǎng)、面積廣，其茶湯滋味強(qiáng)烈剛勁，內(nèi)含物高[3].滇紅創(chuàng)始人馮紹裘先生在《滇紅史略》[12]記述：“沿長(zhǎng)江南北一帶地區(qū)不產(chǎn)冬茶，而云南迤西順寧(鳳慶)初冬尚能生產(chǎn)這樣的高級(jí)紅、綠茶葉，誠(chéng)屬可貴”.

為了解鳳慶大葉種茶樹(shù)入冬后葉片生化成分變化，以鳳慶縣5個(gè)野放茶園為樣地，按節(jié)氣采摘一芽?jī)扇~至三葉新梢，使用多種技術(shù)手段，對(duì)12種重要茶葉生化指標(biāo)(包括6種益生長(zhǎng)元素Mg、Al、Mn、Fe、Zn、Cu[13]，以及6種重要滋味因子(茶氨酸、脯氨酸、總游離氨基酸(TFAA)、水浸出物、茶多酚、水溶性糖))進(jìn)行測(cè)定，對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.本研究結(jié)論不僅可為鳳慶縣典型大葉種茶樹(shù)的生長(zhǎng)輪替特性累積原始數(shù)據(jù)，也可為茶行業(yè)指導(dǎo)茶園茶樹(shù)種植、充分開(kāi)發(fā)茶樹(shù)資源提供參考.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年10—2021年1月，參考茶行業(yè)行規(guī)[14-15]，即秋茶采摘節(jié)氣：白露到中秋；冬季：小寒到大寒，于2020-10-02及2021-01-05，在云南省臨滄市鳳慶縣5個(gè)大葉種野放茶園向陽(yáng)坡面中部，5～20棵茶樹(shù)采摘一芽二葉至三葉新梢(冬季芽葉稀少，其他季節(jié)采樣以冬季茶株分布中心為起始點(diǎn)，向外輻射).由于冬季各樣品芽葉顯著縮小，葉片革質(zhì)化，部分呈現(xiàn)貓耳朵狀，色澤發(fā)黃、水分含量偏低，且部分葉片有焦邊現(xiàn)象.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

樣品采集后使用純凈水快速?zèng)_刷，甩干水分?jǐn)偭栏稍?，冰箱密封冷?臨用前70 ℃烘干后磨碎至60目.水浸出物含量測(cè)定方法參照GB/T 8305—2013[16]；游離氨基酸總量及脯氨酸測(cè)定采用氨基酸分析儀法(GB/T 8314—2013)[17-18]；茶多酚含量測(cè)定采用福林酚比色法(GB/T 8313—2018)[19]；水溶性總糖含量測(cè)定采用蒽酮-硫酸比色法[20]；元素測(cè)定采用混酸[V(高氯酸)∶V(硝酸)=1∶5]消解后的ICP-MS法(GB/T 30376—2013)[21-22].

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS23.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 鮮葉特征生化成分含量

入冬后野放大葉種茶樹(shù)鮮葉樣品相關(guān)生化成分測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 入冬后大葉種茶樹(shù)新梢特征生化成分含量(n=5)

續(xù)表1

茶樹(shù)新梢元素含量主要取決于元素背景值，而次生代謝產(chǎn)物含量主要取決于茶樹(shù)品種和季節(jié)性節(jié)律，受茶樹(shù)生理特性、管理方式等多種因素影響.冬季茶園特殊的水熱條件顯著改變?nèi)~片中次生代謝產(chǎn)物合成機(jī)制，供給茶樹(shù)的氨態(tài)氮為茶氨酸、谷氨酸、精氨酸等主要形式，較為穩(wěn)定地貯藏在茶樹(shù)根部和葉部[3].

各指標(biāo)含量均值變化幅度指征秋冬季節(jié)性差異.從表1可知，6種益生礦質(zhì)元素的含量分異明顯，各元素含量均值含量水平變異達(dá)2個(gè)數(shù)量級(jí).各元素含量平均值的高低順序?yàn)椋簑(Mg)>w(Al)>w(Mn)>w(Fe)>w(Zn)>w(Cu)，此順序與地球陸地植物礦質(zhì)元素含量順序相近[23].但Al和Mn含量有大幅提高(Al提高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，Mn提高1個(gè)數(shù)量級(jí))，體現(xiàn)了大葉種茶樹(shù)的富集偏好[24].入冬后，F(xiàn)e元素含量相對(duì)穩(wěn)定，含量下降的元素為w(Al)>w(Mn)>w(Fe)(變化幅度排序)，含量升高的元素為w(Zn)>w(Mg)>w(Cu)(變化幅度排序).入冬后，野放大葉種茶新梢中，除Fe、茶氨酸較為穩(wěn)定外，脯氨酸、可溶性糖、總游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著升高，水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)整體下降.

指標(biāo)含量的RSD值指征不同樣地間差異.入冬后，Al元素RSD保持穩(wěn)定，RSD增加的元素為RSD(Fe)>RSD(Zn)；含量變幅降低的元素為CV(Mg)>CV(Cu)>CV(Mn)；次生代謝產(chǎn)物中，RSD增加的是RSD(茶多酚)>RSD(水浸出物)>RSD(可溶性糖)，RSD減少的是RSD(脯氨酸)>RSD(茶氨酸)>RSD(TFAA).

總體而言，秋冬季節(jié)相比，F(xiàn)e和茶氨酸含量變幅小，RSD小，在茶樹(shù)體內(nèi)分布較為穩(wěn)定，環(huán)境影響較少；Zn和茶多酚含量雖有變化，但其RSD亦大幅增加，表明其對(duì)多重干擾響應(yīng)明顯，不適宜作為指紋圖譜研究對(duì)象；TFAA和水浸出物雖有變化，但較為輕微，尚不足以成為季節(jié)影響的溯源因子；Mg、Al和脯氨酸含量大幅變化，同時(shí)其RSD穩(wěn)定或減少，說(shuō)明其受土壤環(huán)境影響較小，而對(duì)季節(jié)變化敏感，可作為冬茶特征因子加以研究.

2.2 特征生化成分成對(duì)比較T檢驗(yàn)結(jié)果

對(duì)樣品涉及的5個(gè)樣地的12個(gè)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行成對(duì)比較T檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2和表3.

由表2可知，入冬后，野放大葉種茶新梢中，除Fe外，其余元素均發(fā)生極顯著變化.其中，Mg和Al含量極顯著下降， Zn含量顯著升高，可作為冬茶代表性元素加以研究，其機(jī)理可能與蛋白質(zhì)基因組中A20/AN1-zinc-finger的作用有關(guān)[9].

可溶性次生代謝產(chǎn)物與植物越冬期抗寒性相關(guān).此外，在茶產(chǎn)品沖泡過(guò)程中，它們又能迅速進(jìn)入茶湯，成為水浸出物決定茶湯品鑒結(jié)果.

表2 入冬后大葉種茶樹(shù)新梢元素含量顯著性差異(n=5)

表3 入冬后大葉種茶樹(shù)新梢次生代謝物質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著性差異(n=5)

在茶樹(shù)耐冬機(jī)制下，茶葉呼吸作用下降，細(xì)胞內(nèi)大分子分解為可溶性物質(zhì)(蛋白質(zhì)分解為氨基酸，多糖水解為二糖和單糖等)的速度增加，小分子可溶性次生代謝物聚合速度減緩，以調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，束縛植物水分，供給碳源和反應(yīng)底物，提高寒冷抗性.多種氨基酸貯藏在茶樹(shù)根部和葉部以作為茶樹(shù)的氨態(tài)氮供給源，這使得入冬后總游離氨基酸上升.脯氨酸、可溶性糖在茶樹(shù)受環(huán)境脅迫時(shí)，作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，含量動(dòng)態(tài)增加，以保護(hù)植物，安全避冬[7].茶多酚是茶葉中抗氧化、色素合成的必須中間體，大葉種茶茶多酚含量與光照、水熱、碳源多個(gè)環(huán)境因素相關(guān).冬季茶園溫度大幅下降，且光照強(qiáng)度較弱，導(dǎo)致茶樹(shù)體內(nèi)多酚合成速度明顯下降[3].

水浸出物與茶產(chǎn)品耐泡度、茶湯滋味強(qiáng)度密切相關(guān).TFAA不僅體現(xiàn)茶湯良好口感，也促進(jìn)香氣產(chǎn)生和發(fā)酵過(guò)程.茶氨酸是茶湯中主流風(fēng)味氨基酸，給茶湯帶來(lái)鮮爽滋味.茶多酚含量可指征茶湯苦澀程度.水溶性糖指征茶湯甜醇度、回甘度及厚度感.

總體而言，入冬后野放大葉種茶新梢除茶氨酸外，其余次生代謝產(chǎn)物均發(fā)生了極為顯著的變化.這些滋味物質(zhì)分布特征與秋茶相去甚遠(yuǎn)，有必要進(jìn)行針對(duì)性的工藝開(kāi)發(fā).越冬期茶新梢茶多酚、水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低，脯氨酸、可溶性糖、總游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)極顯著升高，其趨勢(shì)與部分研究成果[7]一致.因此，Mg、Al和脯氨酸可作為越冬茶代表性生化指標(biāo)進(jìn)行深入研究.

2.3 鮮葉中特征生化成分相關(guān)性分析結(jié)果

對(duì)越冬期茶葉的上述12個(gè)特征生化成分進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表4.

由表4可知，元素中Al、Cu、Mg和Zn與其他成分相關(guān)性較強(qiáng).其中：Al與Cu、Zn、脯氨酸、總游離氨基酸、水浸出物呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，與可溶性糖呈顯著正相關(guān)；Cu與Mg呈極顯著正相關(guān)，與脯氨酸、水浸出物、Zn呈顯著正相關(guān)，而與可溶性糖呈極顯著負(fù)相關(guān)；Mg與Zn、脯氨酸、水浸出物呈顯著正相關(guān)，與可溶性糖呈極顯著負(fù)相關(guān)；Mn與Zn呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)；Zn與脯氨酸呈極顯著正相關(guān)，與水浸出物呈顯著正相關(guān)，與可溶性糖呈顯著負(fù)相關(guān)；茶氨酸與所有指標(biāo)未體現(xiàn)顯著相關(guān)性；脯氨酸與Al呈極顯著負(fù)相關(guān)，與Cu 和Mg呈顯著正相關(guān)，與Zn呈極顯著正相關(guān)；茶多酚與脯氨酸、總游離氨基酸呈顯著正相關(guān)，與水浸出物呈極顯著正相關(guān)；可溶性糖與Al呈顯著正相關(guān)，與Cu和Mg呈極顯著負(fù)相關(guān)，與Zn和脯氨酸均呈顯著負(fù)相關(guān).

表4 入冬后大葉種茶樹(shù)新梢特征生化成分相關(guān)性分析結(jié)果(n=5)

Al與可溶性糖兩指標(biāo)孤立于其他指標(biāo)，多呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)狀態(tài).研究認(rèn)為，Al在茶樹(shù)中強(qiáng)富集，可能會(huì)對(duì)其他元素產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)配位，影響其他元素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，這也說(shuō)明雖然茶樹(shù)是喜鋁型物種，但控制種植過(guò)程中鋁元素背景值會(huì)影響其次生代謝過(guò)程，進(jìn)而影響茶產(chǎn)品口感.Al與可溶性糖自身呈顯著正相關(guān)，可溶性糖的生物合成過(guò)程與Al可能關(guān)系密切，而與其他次生代謝物的生物合成路徑有所區(qū)別.Fe與所有指標(biāo)相關(guān)性均未達(dá)顯著性相關(guān)程度，可能在茶樹(shù)以上指標(biāo)的新陳代謝過(guò)程中未起到關(guān)鍵性作用.Mg和Zn與多個(gè)元素體現(xiàn)了相關(guān)性，同時(shí)也與脯氨酸、水浸出物、可溶性糖呈現(xiàn)相關(guān)性.脯氨酸與TFAA、茶多酚、水浸出物、可溶性糖均體現(xiàn)相關(guān)性.因此，它們均可以作為冬茶生化成分指紋因子.

值得注意的是，脯氨酸與Zn呈極顯著相關(guān)性，提示Zn可能參與可溶性蛋白的水解過(guò)程，其代謝機(jī)理值得進(jìn)一步研究.

3 結(jié)果與討論

1)樣品的6種常量礦質(zhì)元素的含量分異明顯，各元素含量平均值的高低順序?yàn)椋簑(Mg)>w(Al)>w(Mn)>w(Fe)>w(Zn)>w(Cu).Al和Mn含量在茶樹(shù)生長(zhǎng)過(guò)程中強(qiáng)富集.

2)入冬前后，礦質(zhì)元素分布特征顯著不同.入冬后含量下降的元素為w(Al)>w(Mn)>w(Fe)(變化幅度排序)，含量升高的元素為w(Zn)>w(Mg)>w(Cu)(變化幅度排序).次生代謝產(chǎn)物除茶氨酸較為穩(wěn)定外，脯氨酸、可溶性糖、游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著升高，水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)整體下降.

3) Mn和茶氨酸在茶樹(shù)體內(nèi)分布較為穩(wěn)定，Zn和茶多酚對(duì)多重干擾響應(yīng)明顯，TFAA和水浸出物不足以成為季節(jié)影響的溯源因子；Mg、Al、脯氨酸受土壤環(huán)境影響較少，對(duì)季節(jié)變化敏感，可作為冬茶特征因子加以研究.

4)成對(duì)比較T檢驗(yàn)結(jié)果表明，元素中Al、Cu、Mg、Zn與其他成分相關(guān)性較強(qiáng).Al與可溶性糖兩指標(biāo)孤立于其他指標(biāo)，常呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)狀態(tài).Mg、Al、Zn、脯氨酸與多個(gè)指標(biāo)均呈現(xiàn)相關(guān)性，可以作為冬茶特征生化成分加以研究.

5)Zn和脯氨酸入冬前后變化極為顯著，且兩者相關(guān)性極強(qiáng)，可作為越冬茶樹(shù)的代表性生化指標(biāo)進(jìn)行代謝機(jī)理研究.

6)云南茶樹(shù)冬季仍緩慢生長(zhǎng)，但野放大葉種茶樹(shù)的原生態(tài)管理使得嫩梢生長(zhǎng)困難，芽頭減少，從而降低了原料采收率.因此，建議在11月下旬入冬前對(duì)野放大葉種茶樹(shù)進(jìn)行輕修剪，以提高產(chǎn)率.

7)由于本實(shí)驗(yàn)涉及的冬茶樹(shù)樣品原料較老，水分含量低，氨基酸、多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯下降，可溶性糖較高，因此，建議將其加工為紅茶及普洱熟茶.在加工過(guò)程中為促進(jìn)多糖的分解和次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，建議提高揉捻程度，采用復(fù)揉工藝和發(fā)酵工藝，以促進(jìn)內(nèi)含物的浸出與轉(zhuǎn)化過(guò)程.

8)今后的進(jìn)一步研究將從茶多糖、兒茶素、黃酮、揮發(fā)性成分含量分布特征，以及元素與茶多糖、蛋白質(zhì)、多酚聚合物等多種次生代謝產(chǎn)物入手，對(duì)野放大葉種茶冬季生化特征進(jìn)行深入調(diào)查.