徐凱紅 嚴笑 楊澍君 張怡 牧啟田 徐志娟 歐陽桂芳

急性白血病患者老齡化呈上升趨勢，因其難以 耐受常規(guī)化療，去甲基化聯(lián)合靶向藥物已成為首選的治療方案[1]。去甲基化藥物通過清除啟動區(qū)的甲基，使因高甲基化而關(guān)閉的抑癌基因重新表達，達到治療的目的[2]。傳統(tǒng)中藥及一些來源于植物的提取物具有去甲基化的作用，相對于化學合成藥物，其對正常組織損傷低，副作用小，如表沒食子兒茶素沒食子酸酯、白蘆藜醇和槲皮素等[3-5]，在腫瘤治療中的優(yōu)勢也越來越明顯。白花丹醌是從白花丹根部分離出來的一種萘醌類化合物，具有抗癌、抗微生物的活性。本課題組前期研究證實了白花丹醌的體內(nèi)外抗白血病作用，提示其可能成為一種新的抗白血病藥物[6]。對白花丹醌藥理作用的繼續(xù)研究中我們發(fā)現(xiàn)，低濃度白花丹醌具有去甲基化的作用，故本研究將白花丹醌作用于人髓系白血病細胞株HL-60，探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和細胞株 白花丹醌（美國Sigma-Aldrich 公 司，批號P7262）；MTS 試劑盒（美國Promega 公司，批號G3582）；細胞基因組DNA 提取試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，批號MT0044）；細胞核蛋白提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號R0050）；DNA 甲基化定量試劑盒（艾德科技北京有限公司，批號A-P-1035）；DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）Activity/Inhibition Assay Ultra Kit（美國Epigentek 公司，批號P-3010）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國Thermo Scientific公司，批號K1622）；SYBR Premix Ex TaqTM（Takara寶生物工程有限公司，批號RR820A）。人急性髓系白血病細胞系HL-60 細胞（上海中科院細胞庫，批號TCHu 23）；引物（上海Sangon 生物工程有限公司）。

1.2 主要儀器 甲基化芯片Infinium Methylation EPIC 850K BeadChip 購自美國illumina 公司；iMark酶標儀購自美國Bio-Rad 公司；PCR 儀為美國ABI公司StepOnePlus 型；Thermo Heraeus 高速低溫離心機；CO2培養(yǎng)箱均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 MTS 法檢測HL-60 細胞生長 制備HL-60 細胞懸液接種于96 孔板內(nèi)，每孔200μL，實驗設置不同的白花丹醌作用濃度（0～2μmol/L），每組分別接種5 個重復孔，設2 個空白對照，作用HL-60 細胞24h后，加入MTS 20μL，于37℃培養(yǎng)箱孵育3h，用酶標儀在490nm 處檢測吸光度值，計算細胞存活率（%）=[（給藥組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）]×100%。

1.4 甲基化水平檢測 收集HL-60 細胞，等量分裝入5 個培養(yǎng)瓶，使白花丹醌0.8μmol/L（根據(jù)MTS 結(jié)果選定）分別作用0、6、12、18、24h，同時設立N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）預處理組（NAC 10mmol/L 預處理HL-60 細胞2h 后，再經(jīng)白花丹醌0.8μmol/L 作用24h）。DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，并記錄各樣本的濃度。根據(jù)甲基化定量試劑盒說明書步驟，確定標準曲線斜率，再根據(jù)以下公式確定樣品5-甲基化胞嘧啶（5-mC）的含量。

1.5 DNMT 活性檢測 白花丹醌0.8μmol/L 分別作用HL-60 細胞0、12、24、36h 后，收集細胞，按照核蛋白提取試劑盒提取各組細胞核蛋白，以BCA 法測定蛋白濃度，用DNMT Activity/Inhibition Assay Ultra Kit 測定經(jīng)白花丹醌不同作用時間后總DNMT 活性。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄-實時熒光定量PCR（RT-qPCR）測定DNMT mRNA 表達 白花丹醌0.8μmol/L 作用HL-60 細胞0、12、24、36h 后，Trizol 提取各組細胞總RNA，用Bio-Rad 酶標儀測定RNA 濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)成cDNA，再予以實時熒光定量PCR 檢測DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT1、DNMT3a、DNMT3b）mRNA 的表達，引物序列見表1。所有引物均在https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/證實其可靠性及真實性。擴增條件：95℃、1min，95℃、15s，60℃、30s，72℃、32s，40 個循環(huán)，根據(jù)2-ΔΔct值計算相對于內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）表達量。

表1 實時熒光定量PCR 檢測甲基化轉(zhuǎn)移酶引物序列

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，實驗獨立重復3 次，兩組數(shù)據(jù)間比較采用獨立樣本t 檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 確定白花丹醌去甲基化作用的研究濃度 用不同濃度（0～2μmol/L）白花丹醌作用HL-60 細胞24h，MTS 法發(fā)現(xiàn)白花丹醌濃度≥1.2mol/L 會對細胞生長產(chǎn)生明顯抑制作用（P＜0.05）（見表2）。因此選取白花丹醌濃度0.8μmol/L 作為不影響細胞生長的研究濃度。

表2 不同濃度白花丹醌對HL-60 細胞生長影響（%，）

表2 不同濃度白花丹醌對HL-60 細胞生長影響（%，）

注：與白花丹醌濃度0μmol/L 比較，aP＜0.05

2.2 白花丹醌對HL-60 細胞甲基化水平影響 DNA甲基化是DNMT 酶類把一個甲基共價連接到胞嘧啶的5 號碳原子上，形成5-mC。因此，通過5-mC 定量檢測來反映甲基化水平。低濃度（0.8μmol/L）白花丹醌作用于HL-60 細胞，發(fā)現(xiàn)5-mC 水平隨著白花丹醌作用時間延長而降低，作用18h 出現(xiàn)明顯差異（P＜0.05），作用24h 差異更加明顯（P＜0.01），見表3。

表3 白花丹醌不同作用時間對HL-60 細胞5-mC 的影響（ng，）

表3 白花丹醌不同作用時間對HL-60 細胞5-mC 的影響（ng，）

注：5-mC 為5-甲基化胞嘧啶；與白花丹醌作用0h 比較，aP＜0.05，aaP＜0.01

2.3 活性氧（ROS）在白花丹醌去甲基化中的作用與對照組比較，單純白花丹醌0.8μmol/L 作用于HL-60 細胞24h，甲基化水平明顯下降（P＜0.01）。若先予NAC 10mmol/L 預處理，再予白花丹醌0.8μmol/L 作用24h，結(jié)果顯示，白花丹醌的去甲基化作用被明顯抑制（P＜0.05）。見表4。

表4 NAC 對白花丹醌去甲基化作用的影響（ng，）

表4 NAC 對白花丹醌去甲基化作用的影響（ng，）

注：NAC 為N-乙酰-L-半胱氨酸；與對照組比較，aP＜0.01；與白花丹醌組比較，bP＜0.05

2.4 DNMT 活性隨著白花丹醌作用時間的延長而降低 白花丹醌0.8μmol/L 作用HL-60 細胞0、12、24、36h 后，提取核蛋白檢測DNMT 活性。結(jié)果顯示，與對照組比較，白花丹醌作用12h 后DNMT 活性明顯下降（P＜0.05），隨著作用時間延長，差異更加顯著（P＜0.01），但是白花丹醌作用24h 和36h，DNMT 活性無明顯差異（P＞0.05），見表5。

表5 低濃度白花丹醌作用不同時間對DNMT 活性的影響（OD·h-1·μg-1，）

表5 低濃度白花丹醌作用不同時間對DNMT 活性的影響（OD·h-1·μg-1，）

注：DNMT 為DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶；與白花丹醌作用0h 比較，aP＜0.05，aaP＜0.01

2.5 低濃度白花丹醌對HL-60 細胞甲基化相關(guān)基因表達的影響 利用RT-qPCR 技術(shù)提取不同作用時間的細胞總RNA，從mRNA 水平檢測相關(guān)基因DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 的表達。除了DNMT3a 基因表達無明顯差異外，DNMT1、DNMT3b 表達均受到白花丹醌不同程度的影響。白花丹醌作用12h 后，DNMT3b 的mRNA 相對表達水平降低（P＜0.05），作用24、36h，其表達水平進一步降低（P＜0.01）。白花丹醌作用36h，DNMT1 mRNA 相對表達水平明顯降低（P＜0.05），見表6。

表6 白花丹醌對HL-60 細胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA 相對表達水平的影響（）

表6 白花丹醌對HL-60 細胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA 相對表達水平的影響（）

注：DNMT1 為甲基轉(zhuǎn)移酶1；DNMT3a 為甲基轉(zhuǎn)移酶3a；DNMT3b 為甲基轉(zhuǎn)移酶3b；與白花丹醌作用0h 比較，aP＜0.05，aaP＜0.01

3 討論

白花丹醌是中草藥提純的化合物，早期研究證實對白血病細胞具有誘導凋亡的作用，作用24h IC50≈9μmol/L[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，在低濃度（0.8μmol/L）不影響細胞生長的情況下，白花丹醌具有去甲基化的作用，這種作用至少需要經(jīng)過18h 才能表現(xiàn)出顯著性差異，符合去甲基化藥物作用持續(xù)時間長、起效緩和的特點[8-9]。NAC 是細胞內(nèi)還原型谷胱苷肽前體物的一種，可以顯著促進細胞內(nèi)還原型谷胱苷肽的合成而提高其含量，從而降低細胞內(nèi)ROS 的水平；因此，NAC 常被用來做ROS 清除劑[10]。我們在前期研究中證實，ROS 是白花丹醌藥理作用的主要中介物質(zhì)，用NAC 阻斷ROS，則幾乎完全阻滯了白花丹醌誘導的凋亡[6]。本研究中我們同樣對白花丹醌的ROS成分進行阻斷，雖然去甲基化程度被大大減弱，NAC預處理組與空白對照組無明顯差異，但是與白花丹醌組的差異程度要小于對照組與白花丹醌組之間的差異，提示阻斷ROS 并不能完全消除白花丹醌的去甲基化作用，考慮白花丹醌去甲基化作用除了ROS主要介導外，可能還與直接影響甲基供體等其他作用方式有關(guān)[11]。

目前研究認為，DNMT 對介導和維持DNA 甲基化至關(guān)重要[12]。DNMT 主要包括DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b 及其亞型。DNMT1 具有維持甲基化的功能，對胚胎的正常發(fā)育至關(guān)重要；DNMT2 的生物功能目前尚不明確；DNMT3a 和DNMT3b 是催化從頭甲基化的主要酶類，能夠建立新的甲基化[13]。本研究從DNMT 活性和基因表達水平檢測，均發(fā)現(xiàn)白花丹醌抑制DNMT 是其實現(xiàn)去甲基化的重要機制。但對于DNMT 不同亞型的抑制效率不同，對DNMT3b 的抑制效率最高，對DNMT3a 則在實驗作用時間內(nèi)未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學上的差異，對DNMT1 則需要作用36h 才出現(xiàn)明顯差異。DNMT1 表達水平的下降，與文獻報道ROS 可以通過直接作用使5-mC 羥基化形成5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC），進而干擾DNMT1 以阻斷甲基化的形成，導致脫氧三磷酸胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸（CpG）位點間接去甲基化的結(jié)果一致[14]。甲基化另一關(guān)鍵酶類是TET（ten-eleven translocation）家族蛋白[15]，它們能將5-mC 氧化修飾為5-hmC，經(jīng)過后續(xù)一系列的堿基切除修復，從而實現(xiàn)DNA 的主動去甲基化。關(guān)于TET 酶類在白花丹醌去甲基化過程中的作用；具體哪些啟動子區(qū)域出現(xiàn)了去甲基化；白花丹醌對體內(nèi)骨髓造血細胞的真實影響，能否通過原代骨髓細胞培養(yǎng)或動物實驗證實，我們將在后續(xù)做進一步的研究。