蘇力合，張凡凡，王旭哲，宋 磊，俞 雪，賀婷婷，馬春暉

(石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是多年生豆科牧草，其產(chǎn)草量高、適口性好、再生能力強[1]。目前我國優(yōu)質(zhì)苜蓿的產(chǎn)區(qū)集中在東北、西北地區(qū)，種植面積約占全國89.8%[2]。新疆是我國主要苜蓿種植區(qū)和草食畜牧業(yè)主產(chǎn)區(qū)，新疆地區(qū)冬季寒冷漫長，種植紫花苜蓿面臨越冬問題，冬季氣候，土壤環(huán)境，品種耐寒性等[3]。苜蓿引種需要根據(jù)其特有的秋眠性(Fall dormancy)特征合理進行栽培生產(chǎn)，以滿足不同生態(tài)區(qū)域的需要[4]。【前人研究進展】抗凍性是受多基因控制的復(fù)雜性狀[5]，且不同地區(qū)的田間環(huán)境條件多變，傳統(tǒng)的育種方法在抗凍性方面只取得了適度的改善[6-7]。【本研究切入點】除了苜蓿自身遺傳的抗寒性之外，田間管理措施也會影響苜蓿的越冬率及抗寒性，越冬前的田間灌水、留茬高度、覆蓋麥草和積雪等在不同程度上都可提高苜蓿的越冬率[8-10]。研究新疆石河子地區(qū)不同秋眠級紫花苜蓿在自然覆雪下越冬率及抗寒生理指標的表現(xiàn)。【擬解決的關(guān)鍵問題】選擇秋眠型(1、3級)、半秋眠型(5級)及非秋眠型(7、9級)紫花苜蓿，從秋季至翌年春季無積雪和自然降雪條件下，分析苜蓿根系可溶性糖(WSC)、可溶性蛋白(SP)、游離脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)含量以及越冬率。為紫花苜蓿品種合理選擇和高效生產(chǎn)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗地位于新疆石河子大學農(nóng)試驗場牧草試驗站(N 44°20′，E88°30′，海拔450.8 m)，地處新疆北部，地勢平坦；屬于溫帶大陸性氣候，冬季長而嚴寒，夏季短而炎熱。年均氣溫2～15℃，無霜期為168～171 d，年降水量為125.0～207.7 mm，年日照時數(shù)為2 721～2 818 h。試驗田前茬作物為棉花。表1

表1 試驗?zāi)?2019年9月～2020年5月)的天氣狀況

1.2 方 法

1.2.1 試驗設(shè)計

供試紫花苜蓿品種共5個。播種時間為2018年4月，設(shè)計小區(qū)面積50 m2(10 m×5 m)，每個品種共3個小區(qū)，相鄰2小區(qū)間隔0.5 m的保護行。種植方式采用穴播，播種深度1～2 cm，行距80 cm，株距60 cm。采取滴灌方式灌溉，以水井為主要水源。表2

表2 紫花苜蓿品種及來源

設(shè)計自然覆雪與不覆雪處理。每個品種選取小區(qū)面積10 m2(5 m×2 m)，每次降雪后及時將雪打掃干凈維持不覆雪狀態(tài)。于2019年9月至2020年5月觀測冬季苜蓿情況。

于2019年11月3日至2020年3月30日，采用多點式土壤溫度記錄儀(i500-E8T，玉環(huán)智拓儀器科技有限公司)測定覆雪與不覆雪下不同土層深度(1和20 cm)和苜蓿冠層處(高于地面5 cm處)的溫度，土壤溫度記錄儀測量時間間隔設(shè)置為10 min，每個土層放置1個溫度探頭。

1.2.2 測定指標

分別于2019年9月8日、10月26日、11月24日、12月29日和2020年1月12日、5月12日從試驗田隨機挖取供試材料10 cm長的根及根莖，清洗干凈放入液氮罐速凍帶回實驗室備測。

可溶性糖(water soluble carbon，WSC)采用蒽酮比色法；可溶性蛋白(soluble protein，SP)采用考馬斯亮藍G-250法；丙二醛(malondialdehyde，MDA)采用硫代巴比妥酸比色法；游離脯氨酸(proline，Pro)采用酸性茚三酮法；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性采用NBT光化學還原法；過氧化物酶(peroxidase，POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法。

于2019年9月最后一茬刈割后在種植各苜蓿品種的小區(qū)內(nèi)選擇觀測每個紫花苜蓿品種樣方內(nèi)(1 m2)越冬前和返青后，在有無覆雪條件下的植株數(shù)，重復(fù)3 次，越冬率計算方法為，越冬率=存活總株數(shù)/植株總數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Ecxel 2010軟件對原始數(shù)據(jù)進行初步整理，用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析，多重比較采用Ducan法。應(yīng)用隸屬函數(shù)法進行紫花苜蓿抗寒性的綜合評價。其中，與抗寒性呈正相關(guān)的指標(SS、SP、Pro、SOD、POD和WSR)采用公式Fijk+=(Xijk-Xmin)/(Xmax-Xmin)計算，與抗寒性呈負相關(guān)的指標(MDA)采用公式Fijk-=1-Fijk+計算，其中Fijk為第i個品種第j個時間第k項指標的隸屬度，Xijk為第i個品種第j個時間第k項指標測定值，Xmax和Xmin為所有參試材料中第k項指標的最大值和最小值。

采用隸屬函數(shù)值法對5個不同秋眠級，6個采樣時間的苜蓿根系SS、SP、MDA、Pro、SOD、POD含量和WSR7個指標進行抗寒性綜合評價。綜合評價分越高，紫花苜蓿抗寒性和越冬率越好，反之則差。

2 結(jié)果與分析

2.1 覆雪與不覆雪處理對紫花苜蓿根冠處、土壤表層(1～20 cm)溫度的影響

研究表明，無積雪與自然降雪下紫花苜蓿根冠處及土壤表層每日平均溫度差異很大。無積雪覆蓋時，暴露在空氣中的苜蓿根冠處溫度上下波動幅度很大，其中在1月11日出現(xiàn)最低溫度(-20.74℃)，在3月10日出現(xiàn)最高溫度(4.98℃)，溫度變化幅度為25.72℃，土壤表層20 cm處溫度在-5～-10℃波動，其中在12月28日出現(xiàn)最低溫度(-12.07℃)，在3月10日出現(xiàn)最高溫度(5.30℃)，溫度變化幅度為17.37℃。田間從2019年11月18日至2020年3月10日間有雪覆蓋，苜蓿根冠處溫度上下波動幅度較無積雪條件小，其中在1月10日出現(xiàn)最低溫度(-7.89℃)，在3月6日出現(xiàn)最高溫度(3.67℃)，溫度變化幅度為11.56℃，遠遠小于無雪覆蓋下的苜蓿根冠處及土壤表層溫度，而土壤表層20 cm處溫度在大部分測量期間都保持在-3℃以上，僅在1月10日出現(xiàn)最低溫度(-4.20℃)，在3月6日出現(xiàn)最高溫度(3.44℃)，溫度變化幅度為7.64℃。圖1

注：1A：無積雪覆蓋；1B:自然降雪

2.2 覆雪與不覆雪下各秋眠級紫花苜?？购碇笜说淖兓?/h3>

2.2.1 根系WSC含量變化

研究表明，各秋眠級紫花苜蓿根系WSC含量在覆雪下整體呈先升后降的趨勢，不覆雪下除了WL903呈先升后降的趨勢外，其他品種呈反復(fù)升降趨勢。2019年10月冷馴化期，各秋眠級苜蓿WSC含量升高，顯著高于9月未降溫期(P<0.05)。11月田間形成有效積雪后，各品種WSC含量表現(xiàn)不同，無積雪覆蓋下，除了WL903品種WSC含量繼續(xù)上升外，肇東、中苜2號和渝苜1號WSC含量較10月顯著下降，但仍高于9月含量(P<0.05)；自然降雪下，各苜蓿品種WSC含量持續(xù)上升，除了中苜2號WSC含量較10月不顯著外，其余各品種WSC含量顯著高于10月(P<0.05)。12月及2020年1月田間穩(wěn)定凍結(jié)期期間，各苜蓿品種在覆雪下的WSC含量均高于不覆雪苜蓿品種(除1月中苜2號外)。2020年5月，各苜蓿品種WSC含量顯著低于冬季(P<0.05)，且在覆雪下的苜蓿品種WSC含量仍高于不覆雪品種。表3

表3 紫花苜蓿根系可溶性糖含量變化

2.2.2 根系SP含量變化

研究表明，不同秋眠級紫花苜蓿根系SP的含量隨氣溫的下降呈先升高后降低的趨勢。2019年10月冷馴化期，各秋眠級苜蓿SP含量緩慢積累，肇東、中苜2號與渝苜1號的SP含量顯著高于9月(P<0.05)。2019年11月隨著寒冷加劇以及降雪，各秋眠級苜蓿SP含量顯著增加并達到最大值(P<0.05)，覆雪條件下Archer含量最高為18.72 mg/g，各秋眠級苜蓿SP含量在覆雪狀態(tài)下整體高于不覆雪的苜蓿(除中苜2號外)。12月至2020年1月各秋眠級苜蓿SP含量開始降低，但仍高于未降溫期，其中覆雪下的中苜2號下降幅度最小，各秋眠級苜蓿SP含量在覆雪狀態(tài)下整體高于不覆雪的苜蓿。2020年5月，各品種SP含量降至最低值，僅無覆雪肇東和覆雪WL903與2019年9月含量差異顯著(P<0.05)。表4

表4 紫花苜蓿根系可溶性蛋白含量變化

2.2.3 根系游離Pro含量變化

研究表明，各秋眠級苜蓿根系游離Pro含量整體呈波浪趨勢，且在覆雪狀態(tài)下各秋眠級苜蓿游離Pro含量整體高于不覆雪的苜蓿。2019年10月冷馴化期，各秋眠級苜蓿其游離Pro含量顯著增加(P<0.05)。11月田間形成有效積雪后，各品種Pro含量表現(xiàn)不同，無積雪覆蓋下，肇東、Archer和WL903顯著上升(P<0.05)，中苜2號較10月小幅度下降但差異不顯著(P>0.05)，渝苜1號較10月小幅度上升但差異不顯著(P>0.05)；覆雪條件下，各品種游離Pro含量均達到最大值，顯著高于其他各時期(P<0.05)，其中中苜2號含量最高為1 384.43 μg/g。2019年12月至2020年1月在無積雪覆蓋下，肇東、Archer及WL903品種較2019年11月其Pro含量呈先降低后上升的趨勢，中苜2號持續(xù)升高，渝苜1號先上升后降低，且各品種在不同月份含量差異顯著(P<0.05)；覆雪條件下，僅中苜2號持續(xù)降低顯著低于2019年11月(P<0.05)，其余各品種呈先降低后上升的趨勢，其中WL903在2020年1月含量最高為1 192.00 μg/g。表5

表5 紫花苜蓿根系游離脯氨酸含量變化

2.2.4 根系MDA含量變化

研究表明，各秋眠級苜蓿根系MDA含量整體呈先下降后上升再下降的趨勢。2019年10月冷馴化期，各秋眠級苜蓿根系MDA含量緩慢降低，除WL903品種外其余品種MDA含量顯著低于9月(P<0.05)，但隨11月冷脅迫期到來及降雪，各秋眠級苜蓿根系MDA含量變化各不相同，肇東MDA含量在無覆雪及覆雪下持續(xù)降低，中苜2號及Archer的MDA含量在無覆雪及覆雪下升高，渝苜1號和WL903的MDA含量在無覆雪下升高，覆雪下降低。12月各品種MDA含量均升至最大值，顯著高于各時期(P<0.05)，其中WL903在不覆雪和覆雪下根系MDA含量最高。2020年1月冷凍穩(wěn)定期，各苜蓿經(jīng)過抗寒脅迫后，其MDA含量開始降低，其中肇東在覆雪下含量最低，渝苜1號在不覆雪下含量最高。覆雪下各秋眠級苜蓿MDA含量均低于不覆雪苜蓿。表6

表6 紫花苜蓿根系丙二醛含量變化

2.2.5 根系SOD含量變化

研究表明，各秋眠級苜蓿根系SOD含量變化與游離Pro含量變化相似，表現(xiàn)為升高→降低→再升高→再降低，且在覆雪條件下各秋眠級苜蓿SOD含量整體高于不覆雪苜蓿(除11月WL903外)。2019年10月冷馴化期，紫花苜蓿感應(yīng)低溫SOD含量急劇上升，其中肇東SOD含量上升幅度最大。11～12月持續(xù)的冷脅迫以及降雪，各秋眠級苜蓿品種SOD含量開始降低，不覆雪條件下，肇東、中苜2號和WL903在11月SOD含量降至最低值，Archer和渝苜1號在12月降至最低值，顯著低于其余時期(P<0.05)；覆雪條件下，中苜2號、渝苜1號和WL903在11月降至最低值，肇東和Archer在12月降至最低值，顯著低于其余時期(P<0.05)。2020年1月冷凍凍結(jié)期，各秋眠級苜蓿在經(jīng)過長時間的抗寒鍛煉后其根系SOD含量又開始上升，不覆雪條件下Archer品種SOD含量顯著高于其余各時期(P<0.05)；覆雪條件下，各秋眠級紫花苜蓿的SOD含量均在2020年1月達到最大值，顯著高于其余各時期(P<0.05)。表7

表7 紫花苜蓿根系超氧化物歧化酶含量變化

2.2.6 根系POD含量變化

研究表明，不同秋眠級紫花苜蓿根系POD含量隨溫度的降低呈先升高后降低的趨勢。2019年10月冷馴化期，各秋眠級苜蓿POD含量逐漸積累。11月隨著寒冷加劇，各秋眠級苜蓿POD含量在覆雪及不覆雪條件下都大幅度上升，顯著高于10月(P<0.05)，其中覆雪條件下的中苜2號上升幅度最大。12月各秋眠級紫花苜蓿的POD含量在覆雪及不覆雪條件下均達到最大值，顯著高于其余時期(P<0.05)，其中Archer在覆雪條件下含量最高為561.15[μ/(g·min)]。2020年1月開始各秋眠級苜蓿POD含量開始下降(不覆雪WL903下降幅度最大)，但各品種仍顯著高于未冷馴化期的含量(P<0.05)，且各秋眠級苜蓿POD含量在覆雪狀態(tài)下整體高于不覆雪的紫花苜蓿。表8

表8 紫花苜蓿根系過氧化物酶含量變化

2.3 覆雪與不覆雪條件對各秋眠級紫花苜蓿越冬率的影響

研究表明，各秋眠級苜蓿品種翌年均能返青。無積雪覆蓋下，Archer、渝苜1號和WL903越冬率分別為77.31%、68.79%和66.99%，顯著低于肇東和中苜2號(P<0.05)。自然降雪下，Archer、渝苜1號和WL903越冬率分別為93.33%、86.67%和73.33%，其越冬率較無覆雪顯著提高(P<0.05)。覆雪下WL903越冬率顯著低于其余品種(P<0.05)。圖2

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.4 覆雪與不覆雪條件對各秋眠級紫花苜?？购院驮蕉实木C合評價

研究表明，在無覆雪條件下，不同秋眠級紫花苜?？购跃C合大小排序為肇東(1級)>中苜2號(3級)>Archer(5級)>WL903(9級)>渝苜1號(7級)；自然降雪條件下：肇東(1級)>中苜2號(3級)>Archer(5級)>WL903(9級)>渝苜1號(7級)。表9

表9 覆雪與不覆雪條件下各秋眠級紫花苜蓿抗寒性和越冬率的隸屬函數(shù)

3 討 論

3.1 覆雪與不覆雪條件對各秋眠級紫花苜蓿根莖土層溫度及越冬率的影響

無積雪覆蓋時，苜蓿秋眠級和越冬率呈現(xiàn)負相關(guān)，高秋眠苜蓿越冬率較低主要由于秋季繼續(xù)生長而未能在根系存儲較多養(yǎng)分[11]，冬季遭受冷凍脅迫耗盡根系養(yǎng)分，使得根系不能抵御凍害(極端氣溫-20.74℃)。在有積雪覆蓋情況下，秋眠級5和7級苜蓿表現(xiàn)出較好的越冬率(與1、3級差異不顯著)，越冬率高的原因是雪的低導熱性和高反射性能提高其覆蓋下的地表溫度[12]，覆雪下相對恒定的根莖及土壤表層溫度對紫花苜蓿造成較低的傷害，李如來[9]的研究結(jié)論相同。岳亞飛等[8]研究結(jié)果表明，秋眠級為10的品種在無積雪覆蓋下翌年未能全部返青，而試驗中秋眠級為9的品種在不覆雪下返青率為66.91%，造成差異的原因可能是其試驗?zāi)晏鞖鉁囟?最低為-31℃)的不同及苜蓿自身遺傳差異，試驗?zāi)贶俎８o溫度最低為-20.74℃，高于其苜蓿根莖溫度，因而高秋眠級苜蓿部分能返青。

3.2 覆雪與不覆雪條件對各秋眠級紫花苜?？购缘挠绊?/h3>

植物在遭受低溫脅迫時，體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、膜透性以及酶的活性都會影響植物的抗寒性[13，14]。研究結(jié)果中，WSC、SP和Pro含量在2019年9月最低，10月冷馴化期顯著上升(P<0.05)，11和12月達到峰值，Castonguay等[6]認為，此時的苜蓿通常達到最大抗逆性，隨后2020年1月開始下降，且覆雪下WSC、SP和Pro含量普遍高于不覆雪條件。冷馴化期秋眠型苜蓿(1、3級)的WSC含量最高，可能是由于秋眠型苜蓿生長停止的時間早，根、冠中早期積累的WSC含量也越高[15]。Cunningham等[16]研究認為WSC可作為衡量苜蓿抗寒性強弱的最有力指標，非耐寒和冬耐寒品種之間的最大耐寒性水平與苜蓿積累WSC的能力有關(guān)。除了苜蓿自身適應(yīng)寒冷之外，冬季覆雪也能顯著提高苜蓿的抗寒性，這點在WSC、SP和Pro含量覆雪下普遍比無積雪含量高可看出，原因是因為雪被使苜蓿根系大多數(shù)時間在相對恒定的溫度下越冬，而無積雪覆蓋時紫花苜蓿根冠處最低溫度可達-20℃，持續(xù)低溫使苜蓿根系發(fā)生凍害，隨之滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量也降低，影響其抗凍性。試驗中Pro含量在整個冬季及翌年春季都保持較高的水平，與申曉慧[17]，張璐[18]等研究結(jié)果一致，其中WL903游離Pro含量在溫度最低時期(1月)表現(xiàn)出與其他品種的差異性，其在不覆雪及覆雪下的含量遠高于其余品種，表明苜蓿抗寒性受多重因素影響，不能單一的用秋眠級或單個指標衡量其抗寒性強弱[19]。 翌年春季天氣回暖，WSC、SP和Pro含量與冬季相比明顯下降，是由于WSC作為春季再生能源被越冬芽萌動消耗，此時苜蓿根系營養(yǎng)由庫端變成源端[20]。

試驗中各秋眠級苜蓿MDA含量呈先降低后上升再降低的趨勢，這與陶雅[21]，張仲鵑[22]等研究結(jié)果相一致。先降低是因為冷馴化引發(fā)苜蓿WSC、SP和Pro的大量積累，有效防止了活性氧對膜脂過氧化作用[17]，另外SOD和POD活性在經(jīng)過冷馴化后增強并協(xié)同作用清除細胞內(nèi)的活性氧，起到保護細胞的作用[12]，但隨著氣溫持續(xù)降低，苜蓿根系滲透物質(zhì)含量及酶活性降低，苜蓿抵抗寒冷減弱引發(fā)MDA含量升高。翌年1月紫花苜蓿根系酶的活性又開始增強，MDA含量開始降低，此間SOD和POD酶通過清除細胞內(nèi)的活性氧自由基來降低膜脂過氧化程度。試驗中高秋眠級苜蓿在覆雪時MDA含量下降，可能是積雪削弱了苜蓿的秋眠性[8]，提高了高秋眠級苜蓿抗凍能力[23]。無積雪覆蓋下的苜蓿MDA含量均高于覆雪下的苜蓿，覆雪可在一定程度上保護苜蓿根系免受凍害。

4 結(jié) 論

覆雪下各品種的平均值均高于無積雪下的苜蓿，覆雪能顯著提高高秋眠級苜蓿的越冬率及抗寒性，秋眠型苜蓿的抗寒性較非秋眠型好。

相比于不覆雪下的紫花苜蓿根冠處最低溫度(-20.74℃)，覆雪可以提高紫花苜蓿根冠處(-7.89℃)及土壤表層20 cm的溫度，保護紫花苜蓿根莖及根系使其安全越冬。紫花苜蓿越冬率表現(xiàn)為秋眠型>半秋眠型>非秋眠型，覆雪下半秋眠型(5級)以及非秋眠型(7級)苜蓿越冬率升高至85%以上，覆雪能顯著提高紫花苜蓿的越冬率。根系保護物質(zhì)含量隨溫度的降低而升高，覆雪下各秋眠級紫花苜蓿根系可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸含量，以及超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性高于不覆雪處理，丙二醛含量低于不覆雪處理。在有積雪覆蓋下秋眠級1和3級的苜?？购员憩F(xiàn)最好。