石維薇， 丁一， 田衛(wèi)東， 郭淑娟

1.口腔轉化醫(yī)學教育部工程研究中心四川大學，四川成都（610041）； 2.口腔再生醫(yī)學國家地方聯(lián)合工程實驗室四川大學華西口腔醫(yī)院，四川成都（610041）； 3. 口腔疾病研究國家重點實驗室國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)院牙周病科，四川成都（610041）； 4. 口腔疾病研究國家重點實驗室國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)學院創(chuàng)傷與整形外科，四川成都（610041）

牙周炎是以牙周支持組織炎癥和破壞為特征的感染性疾病。牙周治療終目的是牙周支持組織的再生與功能重建。牙囊細胞（dental folic cells，DFCs）自我增殖能力強，具有多向分化的潛能，可分化為成骨細胞、成牙骨質細胞、牙周膜細胞（periodontal ligament cells，PDLCs），利于牙周軟硬組織的再生與重建，是牙周組織再生工程中研究較為廣泛的種子細胞［1］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌來源的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）對DFCs 以及PDLCs 的分化作用是不同的。當LPS預處理DFCs 24 h 后，DFCs 膜片能夠上調成骨、成纖維相關基因如堿性磷酸酶、骨鈣素、Ⅲ型膠原（Collagen Ⅲ，Col Ⅲ）的表達，同時對黏附相關基因骨膜蛋白的表達無影響；然而，經(jīng)LPS 刺激后的PDLCs 膜片則表現(xiàn)為成纖維、成骨以及黏附相關基因表達的下調，不利于牙周組織再生。因此，DFCs相較于PDLCs 具有抵抗LPS 刺激調節(jié)炎性微環(huán)境的能力，利于分化形成完整的牙周組織結構［2］。然而，LPS 預處理后的DFCs 促進牙周組織再生的機制尚不明確。外泌體是由細胞分泌的胞外囊泡，直徑為30～100 nm，主要以內出芽的形式產(chǎn)生［3］。與細胞分泌的生長因子不同的是外泌體包裹著豐富的來源細胞的蛋白質、核糖核酸、微小核糖核［4］，具有靶向性，并且這些重要組份使外泌體在疾病的免疫調控［5］、組織損傷修復［6］以及臨床疾病檢測與診斷［7］等過程中發(fā)揮重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可以通過旁分泌機制分泌外泌體替代MSCs 發(fā)揮促進組織缺損修復及骨再生的作用［8］。本實驗旨在探究LPS 預處理DFCs 分泌的外泌體（LPS pretreated DFCs derived exosomes，L-Exos）濃度在10 μg/mL 以及100 μg/mL 時對牙周炎患者的牙周膜細胞（periodontal ligament cells of periodontitis，p-PDLCs）成骨分化功能的影響。為L-Exos 作為替代細胞療法用于牙周組織再生提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

胎牛血清（Gibco，美國）；α-MEM 完全培養(yǎng)液（GE Healthcare Life Sciences，美國）；青鏈霉素（Solarbio，中國）；胰蛋白酶（Millipore，美國）；I 型膠原酶（Sigma，美國）；Trizol（Invitrogen，美國）；茜素紅（Sigma，美國）；CD31、CD34、CD73、CD90、CD106、CD146 和Actin 抗體（Abcam，美國）；CD63 和Alix 抗體（正能，中國）；超濾管（Millipore，美國）；外泌體提取試劑盒（Invitrogen，美國）；掃描透鏡（HT7700 TEM，日本）；納米粒度及Zeta 電位分析儀（Malvern Instruments，英國）；高速離心機（Backman，美國）；Thermo Micro 21R 臺式冷凍離心機（Eppendorf，德國）。本研究獲得四川大學華西口腔醫(yī)院倫理委員會批準，患者知情同意。

1.2 細胞培養(yǎng)與鑒定

1.2.1 DFCs 組織塊酶消化法培養(yǎng) 取12～20 歲健康受試者需要拔除的未發(fā)育完全的智齒。收取包裹于牙冠的牙囊組織，置于10%雙抗磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）中洗凈，剪成0.5～1.0 mm 的細碎組織塊，Ⅰ型膠原酶消化30 min，離心，棄上清，用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）以及2%雙抗的α-MEM 完全培養(yǎng)基洗滌，重懸。將組織平鋪于T25 小瓶中，滴加少量含15%FBS 的α-MEM 培養(yǎng)基，置細胞孵箱中（5%CO2，37 ℃），24 h 后將培養(yǎng)基加至2 mL。每3 d 換液1次，應用倒置顯微鏡觀察細胞狀態(tài)，當細胞生長至60%～80%時用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，取第5代用于后續(xù)實驗。

1.2.2 p-PDLCs組織塊酶消化法培養(yǎng) 取40～60歲被診斷為慢性牙周炎的患者需要拔除的牙（牙周探診深度大于4 mm，探診出血且存在附著喪失），患者知情同意。拔除后置于10%含雙抗的PBS 中，洗凈。刮取收集根中1/3牙周膜組織于I型膠原酶中消化20～30 min，離心，用α-MEM 培養(yǎng)基洗滌，重懸，均勻平鋪于小皿中，滴加少量15%FBS 的α-MEM 培養(yǎng)基，置細胞孵箱中（5%CO2，37 ℃），24 h 后將培養(yǎng)基緩慢加至2 mL。當細胞生長至80%時用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，取第3代用于后續(xù)實驗。

1.2.3 DFCs 細胞表型鑒定 選用P3 代的DFCs，計數(shù)，細胞懸液分裝至1.5 mL 的EP 管中，濃度為2 × 105個/200 μL，含2%FBS 的PBS 洗滌2 次后，每個離心管中加入2 μL 的CD31、CD34、CD73、CD90、CD106 和CD146 抗體在4 ℃下避光孵育1 h，含2%FBS 的PBS 洗滌2 遍。細胞懸液通過200 目的細胞篩，流式細胞儀檢測。

1.3 LPS 刺激DFCs 并提取外泌體進行鑒定

P5 代的DFCs 置于T75 大瓶中培養(yǎng)至80%時，加入250 ng/mL LPS 24 h，PBS 清洗2 遍后，加入無血清培養(yǎng)48 h，收取細胞上清于50 mL 離心管中。于3 000 g 離心30 min，接著采用0.22 μm 的濾器過濾收集的上清，將過濾后的上清（分子粒徑< 220 nm）置于100 KD 的超濾管中，5 000 g/min 離心30 min，得到分子粒徑為30～220 nm 的上清濃縮液，并置于-80 ℃冰箱備用。濃縮液按2∶1 的體積加入外泌體提取試劑，充分混勻，4 ℃孵育過夜，10 000 g/min 離心60 min，沉淀即為L-Exos。將離心后得到的白色沉淀溶于生理鹽水后，2%戊二醛固定1 h，進行透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察外泌體的結構；納米顆粒追蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）技術分析外泌體粒徑分布范圍；蛋白印跡（Western Bolt）法檢測其表面標記物。

外泌體溶解在RIPA裂解緩沖液中，通過BCA方法計算蛋白總量后，將裂解液與蛋白緩沖液按比例混合，最終將濃度調至為1 μg/μL［9］。將封閉后的膜分別與CD63（1∶1 000，Zen Bioscience，China，615509）、Alix（1∶1 000，Zen Bioscience，China，341000）和Actin（1∶1 000，Abcam，ab3280）的一抗在4 ℃過夜，然后在室溫下二抗孵育1 h，進行檢測。

1.4 經(jīng)LPS 刺激DFCs 后的外泌體對p-PDLCs 的分化影響

1.4.1 RT-PCR P3 代的p-PDLCs 以5 × 105個細胞/孔的細胞數(shù)接種至12 孔板，待細胞貼壁至60%約24 h 后，將L-Exos 重懸于培養(yǎng)基中分別以10、100 μg/mL 的濃度加入p-PDLCs 中（對照組加入相應劑量的PBS），在誘導7 d 后，每孔加入500 μL Trizol 裂解液，分離提取RNA，并逆轉錄為cDNA［10］。利用RT-PCR 儀進行熒光定量檢測分化相關基因：Periostin、Ⅰ型膠原（Collagen Ⅰ，Col Ⅰ）、Col Ⅲ、轉化生長因子-化（transforming growth factorβ1，TGF-β1），引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4.2 L-Exos對p-PDLCs成骨的影響 將P3代的p-PDLCs 分別以5×105個細胞/孔接種于12孔板中，待細胞貼壁至60%約24 h后，將L-Exos重懸于成骨誘導培養(yǎng)基中分別以10、100 μg/mL的濃度加入p-PDLCs中。7 d 后，棄上清，PBS 洗滌，4%多聚甲醛固定15 min，按參照文獻方法［11］進行茜素紅染色、礦化結節(jié)的觀察以及半定量分析。其中成骨誘導液為含5 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/mL 維生素C、100 mmol/L 地塞米松、10%FBS 的α-MEM 培養(yǎng)液。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，多組均值的比較采用單因素方差分析，組間比較運用Bonferroni 法進行兩兩比較，檢驗水準α＝0.05。

2 結 果

2.1 DFCs 與p-PDLCs 的培養(yǎng)

在DFCs 分離培養(yǎng)3 d 后，細胞開始從組織塊中緩慢爬出，爬出的細胞以組織為中心呈放射狀向周圍排列，長梭形，胞體飽滿，偶有散在上皮團從組織塊分離，10 d 后多處組織塊中大部分的細胞已分離爬出，細胞生長匯合達培養(yǎng)瓶的60%～70%（圖1a）。p-PDLCs分離培養(yǎng)4～7 d后開始有少量p-PDLCs 遷移出組織塊，無序排列，為典型的成纖維樣。15～20 d 后爬出的細胞增多，呈旋渦狀或放射狀細胞簇散在鋪于培養(yǎng)皿（圖1b）。

Figure 1 The cell culture of DFCs and p-PDLCs圖1 牙囊細胞和牙周炎患者的牙周膜細胞原代培養(yǎng)

2.2 DFCs 的鑒定

DFCs 的表面標記物CD73、CD90、CD146 陽性表達，并且CD31、CD106、CD34 顯示陰性，因此分離培養(yǎng)的DFCs 來源于間充質干細胞，并非造血干細胞來源（圖2）。

Figure 2 Flow cytometry analysis for DFCs圖2 DFCs 的流式細胞術分析

2.3 外泌體的鑒定

L-Exos 是直徑為30～100 nm 的囊泡樣結構，囊泡周緣可觀察到脂質雙分子層（圖3a）。將白色沉淀溶于生理鹽水后，納米顆粒追蹤分析結果如圖3b 示，所提取的L-Exos 直徑大小的峰值主要分布在100 nm 左右。運用Western Blot 檢測囊泡表面標記物CD63 、外泌體特有標記物ALG-2 相互作用蛋白X（ALG-2-interacting protein X，Alix）以及細胞的表面標記物肌動蛋白水平，結果顯示提取物強陽性表達CD63 和Alix，不表達細胞表面標記物Actin，而對照組細胞的結果則與之相反（圖3c）。進而證明，該方法提取的分離物為外泌體。

2.4 L-Exos 對p-PDLCs 成骨向分化的影響

RT-PCR檢測Periostin、Col Ⅰ、Col Ⅲ、TGF-β1的表達，10、100 μg/mL L-Exos組中Periostin和Col Ⅰ的表達均高于對照組（P<0.05），且濃度為100 μg/mL時的表達量更高；Col Ⅲ在100 μg/mL 外泌體組的表達為對照組以及10 μg/mL 外泌體組的2 倍（P <0.01），而TGF-β1 的表達則在10 μg/mL 外泌體組呈現(xiàn)出最高的表達量（P<0.01，圖4）。

細胞茜素紅染色結果顯示，與對照組比較，10、100 μg/mL 濃度的外泌體組均可見到茜素紅染料標記的陽性礦化結節(jié)（F＝237.761，P<0.01），且100 μg/mL 外泌體組鈣結節(jié)數(shù)量多于10 μg/mL 組（P<0.01，圖5）。

Figure 3 Identification of exosomes圖3 外泌體的鑒定

Figure 4 The expression of L-Exos-induced p-PDLC osteogenic and adhesion-related genes was detected by RT-PCR圖4 RT-PCR 檢測L-Exos 對p-PDLCs 成骨相關基因表達

3 討 論

Figure 5 Alizarin red staining and quantitative analysis of L-exos-induced p-PDLC osteogenesis induction after 7 d圖5 L-Exos 對p-PDLCs 成骨誘導7 d 茜素紅染色及半定量分析

越來越多的研究表明MSCs 除了通過自我增殖分化加速組織修復外，還可通過其分泌外泌體等調節(jié)內源性干細胞分化、增殖從而促進受損的組織的愈合［12］。基于目前的研究，外泌體的提取方法主要為蔗糖-密度梯度離心法、超速離心法、超濾法以及商品化試劑盒法（類似于聚合物沉淀）等［13］。由于目前外泌體提純技術的局限性，無論是超速離心法還是試劑盒法提取的外泌體均可能含有小的細胞外囊泡或其他成分，如同等大小的脂質體、蛋白質等，而不是單純的外泌體［14］。因此針對提取方法的選擇問題，國際細胞外囊泡協(xié)會指出提取方法的選擇應以所需的囊泡純度和濃度為指導［13］。本實驗旨在初步探究牙囊細胞外泌體對p-PDLCs 的作用，因此選用商品化的試劑盒作為本實驗外泌體的提取方法。在本研究中，透射電鏡結果顯示外泌體形態(tài)大小不一，直徑在30～100 nm 之間，具有脂質雙分子層結構，NTA 檢測外泌體粒徑分布發(fā)現(xiàn)外泌體樣本大小峰值在100 nm，這些特性同先前文獻結果是一致的［15］。此外，根據(jù)蛋白質組學研究，與細胞相比，外泌體特異性表達四跨膜蛋白，如CD63、腫瘤易感基因101 蛋白（tumor susceptibility gene 101，TSG101）、Alix 等［15］。本實驗Western Blot 結果顯示提取的外泌體樣本高表達CD63、Alix 而不表達Actin，由此認為通過本實驗方法提取的是牙囊細胞外泌體。

DFCs在牙發(fā)育過程中分化形成牙骨質、牙周膜以及牙槽骨，是形成牙周組織的前體細胞，取材方便，增殖分化能力強，是牙周組織工程中常用的一種種子細胞［1］。同時本課題組的前期研究將牙齦卟啉單胞菌來源的LPS 預處理DFCs 24 h 后其細胞膜片表現(xiàn)出較PDLCs更強的成骨、成膠原能力，更有利于牙周組織再生［2］。然而，LPS 預處理后的DFCs 分泌的外泌體對牙周組織作用的機制尚不明確。

研究表明，MSC 分泌的外泌體可促進組織內源性細胞增殖和分化能力。而目前外泌體對于牙周組織再生的研究是局限的。Jiang 等［16］發(fā)現(xiàn)乳鼠切牙MSCs 外泌體在濃度為10 μg/mL 時能明顯升高上皮細胞堿性磷酸酶活性，牙本質涎蛋白表達，促進礦化物質形成，效果優(yōu)于濃度為0.1 μg/mL、1 μg/mL 的MSCs 外泌體。Chew 等［17］將40 μg MSCs外泌體載入膠原海綿中治療大鼠牙周缺損發(fā)現(xiàn)，MSCs 外泌體通過增強PDLCs 的增殖分化功能促進牙周缺損的骨修復，但結果中的牙槽骨的再生效果不佳，而高濃度的外泌體對細胞分化影響尚不明確，如何提高外泌體的效能是急需解決的問題。本研究發(fā)現(xiàn)100 μg/mL L-Exos 上調p-PDLCs 成骨相關基因ColⅠ、Col Ⅲ的表達以及黏附相關基因Periostin 的表達。Periostin 是一種基質細胞蛋白，可調節(jié)細胞遷移、募集、黏附，表達于各種組織的愈合區(qū)域［18］，在牙周組織及其周圍骨的再生中起重要作用［19］。ColⅠ是最早發(fā)現(xiàn)的成骨細胞標志物之一，它在成骨前體細胞中表達上調并沉積為細胞外基質，是早期成骨細胞分化的標志［20］。Col Ⅲ對膠原彈性有重要作用，在組織修復初期Col Ⅲ含量較高，隨后逐漸被ColⅠ替代［21］。這些基因的表達水平上調均能調控牙周骨組織再生，增強p-PDLCs的成骨能力。研究表明，TGF-β1 對間充質細胞和某些其他特定細胞類型如牙周膜細胞、成纖維細胞，和成骨細胞等具有增強細胞活性，促進細胞生長的能力［22］。在本實驗中，TGF-β1 基因在10 μg/mL L-Exos 組相對表達量明顯高于100 μg/mL L-Exos組，這表明在誘導7 d 后，10 μg/mL L-Exos 組p-PDLCs 增殖活性較強，而100 μg/mL L-Exos 組p-PDLCs 成骨向分化能力較強，進而證明100 μg/mL L-Exos 較10 μg/mL L-Exos 具有更強的促進p-PDLCs成骨向分化能力，益于牙周組織再生。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)LPS預處理后的牙囊細胞外泌體具有促進p-PDLCs的成骨向分化能力，并且當外泌體濃度為100 μg/mL時較10 μg/mL效果更佳，為后期實驗對外泌體濃度的選擇提供研究依據(jù)。但仍有很多問題需要后續(xù)進一步研究，如動物體內研究以及L-Exos促進p-PDLCs可能存在的機制。

【Author contributions】Shi WW processed and analyzed the data，wrote the article. Ding Y，Tian WD revised the article. Guo SJ designed the study，guided the writing of the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.