孫翟，李文

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院，上海200030

當(dāng)前全球出生人口急劇下跌，我國2020年總生育率降至1.3[1]，創(chuàng)歷年新低，低于國際公認(rèn)的1.5 警戒線。2006—2017年女性平均初育年齡從24.3 歲推遲至27.3 歲[2]，如今三胎政策下部分再生育女性年齡接近40 歲。女性生育力受卵巢功能直接影響，育齡推遲往往伴隨卵巢功能下降和衰退，導(dǎo)致女性生殖衰老、生育力降低乃至喪失。面對生育率下降的嚴(yán)峻形勢和高齡女性生育挑戰(zhàn)，探究卵巢衰老的影響因素、發(fā)生機(jī)制及有效的生育力保存策略，對于女性生殖健康及社會(huì)發(fā)展有著重要意義。

1 卵巢衰老概述

卵巢衰老（ovarian ageing）是卵巢功能逐漸衰退的過程, 受年齡、遺傳、環(huán)境和醫(yī)源性等多種因素影響，以卵泡數(shù)量減少和質(zhì)量降低為特征，最終表現(xiàn)為絕經(jīng)并影響全身多系統(tǒng), 可導(dǎo)致生殖功能喪失及相關(guān)疾病的發(fā)生[3-4]。年齡相關(guān)的卵巢衰老是一個(gè)生理性變化過程。當(dāng)此過程發(fā)生過早或加速時(shí)，異常狀態(tài)可與臨床中幾個(gè)診斷概念對應(yīng)，包括卵巢儲(chǔ)備減退（diminished ovarian reserve, DOR）、卵巢低反應(yīng)（poor ovarian response, POR）、早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency, POI）和卵巢早衰（premature ovarian failure, POF），它們均為卵巢衰老不同階段或不同程度的特殊表現(xiàn)，強(qiáng)調(diào)的側(cè)重點(diǎn)也各有不同[5]，目前POI 和POF 是臨床和科研中最常提及的概念。40 歲以下育齡女性中，約1%的人群受到POI困擾[6]，大部分POI 為特發(fā)性，病因不明。對于仍處于育齡期的POI 患者，生育力保存顯得尤為重要和緊迫。

2 卵巢衰老病因及發(fā)生機(jī)制

2.1 DNA 損傷、端粒及端粒酶、活性氧和線粒體功能障礙

2.1.1 DNA 損傷 DNA 損傷監(jiān)測和修復(fù)機(jī)制確保了卵母細(xì)胞的質(zhì)量和正常發(fā)育。DNA 損傷應(yīng)答（DDR）和紡錘體組裝檢查點(diǎn)（SAC）能有效識(shí)別細(xì)胞周期中大部分的DNA 損傷[7]。隨年齡增長，胞內(nèi)損傷監(jiān)測和修復(fù)機(jī)制效率降低，導(dǎo)致DNA 損傷累積，最終造成卵母細(xì)胞死亡。

2.1.2 端粒及端粒酶 端粒對于維持染色體完整性至關(guān)重要，端粒酶的作用在于維持端粒長度。卵巢衰老往往伴隨端粒縮短，研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞端粒較長的女性進(jìn)入更年期時(shí)間比端粒短者晚約3年[8]，POI 患者卵泡顆粒細(xì)胞端粒長度變短，端粒酶活性降低[9]，提示端粒及端粒酶參與調(diào)節(jié)卵巢衰老進(jìn)程[10]。

2.1.3 活性氧（reactive oxygen species，ROS）ROS 可加速體細(xì)胞和生殖細(xì)胞老化，過量ROS 可造成胞核及線粒體DNA 損傷及細(xì)胞凋亡[11]。在小鼠中證實(shí)，長期氧化應(yīng)激狀態(tài)使卵泡數(shù)減少且降低卵母細(xì)胞質(zhì)量[12]。抗氧化劑NAC 可增加氧化應(yīng)激小鼠的卵母細(xì)胞端粒長度和端粒酶活性[13]，從而減輕氧化損傷，延緩卵母細(xì)胞衰老。

2.1.4 線粒體含量及功能 卵母細(xì)胞含豐富的細(xì)胞質(zhì)及線粒體，線粒體不僅為卵母細(xì)胞成熟、受精和胚胎發(fā)育提供能量，還參與鈣離子穩(wěn)態(tài)、凋亡和自噬的調(diào)節(jié)[14]。MII 期卵母細(xì)胞線粒體DNA（mtDNA）含量與年齡呈負(fù)相關(guān)，高齡會(huì)導(dǎo)致mtDNA 突變率增加，卵母細(xì)胞發(fā)育潛力降低[15]。與卵巢儲(chǔ)備正常的同齡女性相比，POI 女性外周血細(xì)胞mtDNA 拷貝數(shù)更低[16]。

2.2 遺傳因素

2.2.1 基因突變 研究提示自然絕經(jīng)年齡是可遺傳的，全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS) 揭示了與絕經(jīng)年齡相關(guān)的數(shù)十個(gè)基因遺傳位點(diǎn)[17-18]。FSH、FSHR、LH、LHR、CYP17 和CYP19 等通過激素作用影響卵泡功能，而BMP15、GDF9 和GPR3 等基因突變可導(dǎo)致卵泡池減少和生殖壽命縮短[19-20]。后續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)了在卵泡發(fā)育、卵泡池維持和卵巢衰老中的非常規(guī)功能基因如等，其突變或缺失可造成小鼠的生殖衰老或POI 發(fā)生[4]。以上基因參與卵巢衰老的具體機(jī)制尚不完全清楚，F(xiàn)MR1 突變與脆性X 綜合征相關(guān)，MYADML 參與調(diào)節(jié)FSH 和AMH 水平，部分可能通過調(diào)控卵泡發(fā)育和線粒體功能等途徑[4]。

2.2.2 表觀遺傳修飾 卵母細(xì)胞發(fā)生和早期胚胎發(fā)育過程中，建立適當(dāng)?shù)谋碛^遺傳修飾是一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。卵母細(xì)胞在衰老中會(huì)發(fā)生表觀遺傳修飾異常，涉及DNA、RNA、組蛋白的乙?；图谆冗^程[21-23]。研究顯示顆粒細(xì)胞中去甲基化酶FTO 調(diào)控m6A 修飾，參與延緩卵巢衰老[24]。研究表觀遺傳修飾有望對闡明特發(fā)性POI 病因及機(jī)制帶來新方向。

2.3 微環(huán)境改變 近年來提出了炎癥老化概念，認(rèn)為慢性促炎狀態(tài)在POI 發(fā)病中起重要作用[25]。促炎細(xì)胞因子、巨噬細(xì)胞和膠原沉積共同構(gòu)成異常炎癥微環(huán)境。老齡小鼠卵巢中存在單核細(xì)胞募集和巨噬細(xì)胞激活增強(qiáng)[26]，多核巨細(xì)胞被認(rèn)為是潛在的炎性卵巢衰老標(biāo)志物[27]。當(dāng)小鼠卵巢炎癥狀態(tài)被抑制時(shí)，巨噬細(xì)胞浸潤減少，卵泡儲(chǔ)備也能保持穩(wěn)定[28]。此外，胞外基質(zhì)沉積導(dǎo)致的卵巢間質(zhì)纖維化也與卵巢衰老相關(guān)[29]。

2.4 醫(yī)源性因素 治療手段多樣化同時(shí)帶來了性腺毒性和生殖功能損害。手術(shù)機(jī)械和高溫?zé)釗p傷破壞卵巢血供及正常組織結(jié)構(gòu)，造成卵巢功能下降及卵泡生長發(fā)育障礙[30]。細(xì)胞毒性藥物如雷公藤制劑[31]和環(huán)磷酰胺等化療藥物可造成卵母細(xì)胞凋亡，化療還可導(dǎo)致卵巢間質(zhì)纖維化，影響微血管形成[32], 放療電離輻射直接損傷卵母細(xì)胞DNA。

3 女性生育力保存的方法

由于卵巢功能不可逆和卵巢組織不可再生性，女性生育力保存非常必要。其旨在通過藥物、手術(shù)或?qū)嶒?yàn)室技術(shù)，為各種因素導(dǎo)致卵巢衰老、存在不孕風(fēng)險(xiǎn)的女性保存其生育后代的能力。目前部分生育力保存技術(shù)已經(jīng)較為成熟并應(yīng)用于臨床，如胚胎/卵母細(xì)胞冷凍。部分技術(shù)還需優(yōu)化和完善，保存效率有待提升，同時(shí)隨著交叉學(xué)科發(fā)展，一些新興技術(shù)在生育力保存領(lǐng)域的應(yīng)用正處于探索和實(shí)驗(yàn)階段。

3.1 改善卵巢功能的藥物 基于ROS 在卵巢衰老中的關(guān)鍵作用，抗氧化劑如VitC、NAC、褪黑素和CoQ10等在延緩卵巢衰老中起一定作用，部分激素也參與調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育和衰老[33]。脫氫表雄酮（DHEA）可以改善POR 患者卵巢儲(chǔ)備，使用后IVF 妊娠率達(dá)16.7%[34]。生長激素（GH）通過IGF-1 途徑促進(jìn)卵泡發(fā)育[35]，40 歲以上IVF患者中GH應(yīng)用組臨床妊娠率為31.8%，顯著高于對照組[36]。端粒酶激活劑、表觀遺傳和免疫調(diào)節(jié)劑也能一定程度上抵抗卵巢衰老[33]，但目前仍處于實(shí)驗(yàn)階段。

3.2 胚胎/卵母細(xì)胞冷凍 自1983年首次報(bào)道人冷凍胚胎成功妊娠以來[37]，胚胎冷凍尤其玻璃化冷凍已被廣泛應(yīng)用于臨床，成為生殖中心的常規(guī)程序。其簡單經(jīng)濟(jì)、冷凍過程穩(wěn)定、胚胎復(fù)蘇存活率及妊娠率高，已成為目前生育力保存最常用方法，尤其已婚女性推薦首選。卵母細(xì)胞冷凍適用于單身和年輕女性。卵母細(xì)胞體積大、含水量高導(dǎo)致其容易受低溫?fù)p傷，凍融有一定難度。目前成熟卵母細(xì)胞玻璃化凍融率可達(dá)80%～95%，胚胎移植周期平均臨床妊娠率為30%，累積活產(chǎn)率為33%[38]。

3.3 卵巢組織冷凍（ovarian tissue cryopreservation,OTC）和體外激活技術(shù) 凍存卵巢組織中存在大量始基卵泡，移植后可一定程度恢復(fù)卵巢功能。截至2017年，通過OTC 誕生的活產(chǎn)嬰兒超過130 例[41]。1 項(xiàng)薈萃分析[42]顯示卵巢組織冷凍臨床療效令人欣喜，活產(chǎn)率57.5%、持續(xù)妊娠率37.7%、內(nèi)分泌恢復(fù)率達(dá)63.9%。但仍存在難題亟待解決，首先是移植后血管重建緩慢、血流灌注不足導(dǎo)致的卵泡損失[43]。研究[44]發(fā)現(xiàn)通過同步移植3D 細(xì)胞外基質(zhì)、或給予重組人促紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮生長因子、丹參提取物等，可顯著加速新血管生成，改善卵巢移植效果。此外，卵巢組織冷凍存在原發(fā)腫瘤再播散風(fēng)險(xiǎn)，因此在腫瘤患者應(yīng)用中需多學(xué)科謹(jǐn)慎評估。

3.4 干細(xì)胞移植和卵胞漿線粒體移植 近年來干細(xì)胞成為研究熱點(diǎn)之一，研究已證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞可修復(fù)卵巢損傷并恢復(fù)卵巢功能[49-50]。此外，Katsuhiko 等[51]利用胚胎干細(xì)胞和多能干細(xì)胞誘導(dǎo)形成原始生殖樣細(xì)胞，將其移植回小鼠體內(nèi)并發(fā)育成卵母細(xì)胞，經(jīng)體外成熟受精后獲得子代。目前干細(xì)胞治療POI 療效還缺乏較大規(guī)模臨床研究數(shù)據(jù)支持，同時(shí)來源、安全性和倫理問題限制了其廣泛應(yīng)用。

卵巢衰老與卵胞漿線粒體功能障礙有密切關(guān)系。最初通過異體卵胞漿置換可改善卵母細(xì)胞質(zhì)量并提高妊娠率，但由于線粒體基因異質(zhì)性，子代存在“三父母”倫理爭議[52]。近來在小鼠和人體均發(fā)現(xiàn)了卵源干細(xì)胞，為新興的自體生殖系線粒體能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（AUGMENT）帶來了廣闊的應(yīng)用前景[53]。

3.5 人工卵巢和卵泡體外培養(yǎng)技術(shù) 人工卵巢是將分離出的原始卵泡嵌入生物支架后進(jìn)行培養(yǎng)和移植。卵泡支撐材料包括血漿凝膠、海藻酸鹽、微孔水凝膠、細(xì)胞外基質(zhì)等[44,54]。卵泡體外培養(yǎng)技術(shù)目前仍處于實(shí)驗(yàn)性階段，有研究將小鼠次級卵泡培養(yǎng)獲得GV 期卵母細(xì)胞，經(jīng)體外受精得到子代[55]，尚未有人體卵泡體外培養(yǎng)成熟并妊娠的報(bào)道。對于卵巢組織冷凍中有腫瘤播散風(fēng)險(xiǎn)的患者，這兩項(xiàng)新興技術(shù)有望為生育力保存提供新方法。

4 展望

隨社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和醫(yī)療水平提升，生理性卵巢衰老及環(huán)境、醫(yī)源性等因素造成的卵巢早衰已經(jīng)成為影響女性卵巢功能和生育需求、威脅生殖健康的主要原因。倡導(dǎo)女性適齡結(jié)婚和生育，這是保證生育力最自然高效的途徑，醫(yī)患的生育力保存意識(shí)也亟待加強(qiáng)。同時(shí)，需要深入研究卵巢衰老的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，建立卵巢衰老早期評判標(biāo)準(zhǔn)和預(yù)警機(jī)制，為生育時(shí)機(jī)的選擇提供參考。目前，改善卵巢功能藥物治療效果有限；線粒體移植和干細(xì)胞治療缺少大規(guī)模臨床研究證據(jù)，細(xì)胞來源和安全性有待完善；卵巢組織冷凍還缺乏相應(yīng)的技術(shù)規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)。因此，繼續(xù)推進(jìn)生育力保存的基礎(chǔ)和臨床研究、改善和創(chuàng)新生育力保存技術(shù)、構(gòu)建規(guī)范和高效的生育力保存診療體系是未來需要繼續(xù)努力的方向。