趙萍 段云友

目前，癌癥是威脅我國(guó)人民健康的主要公共問(wèn)題，也是主要死亡原因。細(xì)胞凋亡在癌癥治療中具有重要作用，與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1］?，F(xiàn)有的手術(shù)、放療、化療、免疫療法及靶向藥物等治療手段均是以激活細(xì)胞凋亡作為殺死癌細(xì)胞的主要途徑［2-4］，表明實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡水平已成為早期評(píng)價(jià)腫瘤治療反應(yīng)的一項(xiàng)指標(biāo)。影像學(xué)成像技術(shù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡水平有助于臨床全面了解腫瘤發(fā)展情況，實(shí)時(shí)指導(dǎo)治療方案，對(duì)預(yù)后效果的評(píng)估也具有重要意義。本文就超聲成像在細(xì)胞凋亡監(jiān)測(cè)中的研究進(jìn)展及在早期評(píng)估腫瘤治療反應(yīng)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

一、高頻超聲在細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用

細(xì)胞凋亡的典型特征是細(xì)胞皺縮、質(zhì)膜出泡、細(xì)胞器或核膜周圍的染色質(zhì)濃縮、DNA片段化等細(xì)胞結(jié)構(gòu)與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變［5］。既往有學(xué)者［6-8］利用超聲對(duì)組織結(jié)構(gòu)的敏感性檢測(cè)體內(nèi)細(xì)胞凋亡，顯示出良好的效果。Tadayyon等［9］應(yīng)用高頻超聲（40～50 MHz）開(kāi)展細(xì)胞死亡診斷研究發(fā)現(xiàn)，凋亡區(qū)超聲反射信號(hào)強(qiáng)度最高可增加16倍。由于化療引起的凋亡組織與周邊結(jié)構(gòu)的聲阻抗存在差異，Pasternak等［10］以高頻超聲（頻率>20 MHz）成像技術(shù)定性和定量評(píng)估癌細(xì)胞的死亡程度和死亡類型，進(jìn)而評(píng)估化療療效。盡管以上研究極大地推進(jìn)了超聲成像對(duì)細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展，但其使用的超聲頻率高于大多數(shù)臨床設(shè)備使用頻率。換能器頻率越高，聲波的穿透性就越低，這種超聲信號(hào)的高度衰減，使穿透深度多為1～5 cm［11］，限制了臨床對(duì)某些深部腫瘤病變的診斷。最重要的是，高頻超聲診斷仍基于解剖學(xué)水平，顯示的是部分分子改變的終效應(yīng)，并非治療反應(yīng)早期的分子水平事件，且缺乏特異性和敏感性，臨床應(yīng)用受限。

二、超聲分子成像在細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用

超聲分子成像是研究活體內(nèi)具有重要作用的關(guān)鍵蛋白分子成像情況，具有無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)、便捷等優(yōu)勢(shì)［12］，其成像基礎(chǔ)和先決條件是開(kāi)發(fā)具有特異性高、敏感性強(qiáng)、靶向性好的超聲分子探針［13］?；谠撛恚暦肿映上裨u(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)就是開(kāi)發(fā)具有靶向凋亡細(xì)胞的特異性分子成像探針。以下對(duì)不同靶向分子探針在細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1.靶向磷脂酰絲氨酸（PS）的分子探針：PS是細(xì)胞膜上的主要磷脂之一，占磷脂總含量的2%～10%［14］。正常細(xì)胞中，PS位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡發(fā)生早期，PS可從膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到膜表面，暴露于細(xì)胞外環(huán)境中。因此，PS是暴露于凋亡早期的生物標(biāo)志物，靶向PS的分子探針已被廣泛用于凋亡成像研究。Annexin V（AV，也稱Annexin A5）作為一種磷脂結(jié)合蛋白，能以Ca2+依賴方式以納米級(jí)親和力與PS高度結(jié)合［14］。Min等［15］在普通微泡上連接Annexin A5對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的兔心臟平滑肌細(xì)胞進(jìn)行凋亡監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明該靶向造影劑能增強(qiáng)治療早期凋亡的成像效果。Wei等［16］以人源Her-2陽(yáng)性乳腺癌接種后的鼠移植瘤為模型，將納泡連接AV用于凋亡靶向成像，結(jié)果顯示藥物曲妥單抗的療效良好。2018年，本課題組［17］以AV為分子探針制備了一種靶向納米級(jí)脂質(zhì)納泡AV-Nanobubbles（AV-NBs），用于評(píng)價(jià)腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)AV-NBs可特異性聚集于順鉑誘導(dǎo)的乳腺荷瘤裸鼠體內(nèi)異位移植瘤細(xì)胞凋亡區(qū)，超聲靶向分子成像顯示凋亡區(qū)呈現(xiàn)明顯高增強(qiáng)，且AV-NBs在靶區(qū)的滯留時(shí)間較普通納泡和聲諾維更長(zhǎng)；該研究為無(wú)創(chuàng)、監(jiān)測(cè)活體抗腫瘤反應(yīng)，以及早期精準(zhǔn)評(píng)價(jià)療效提供了參考。Annexin V-128是AV的突變體，其N端包含更多結(jié)合位點(diǎn)。相較于AV，Annexin V-128在腎臟的代謝更快，對(duì)腎臟毒性作用更低，其N段結(jié)構(gòu)域較AV更長(zhǎng)；但二者誰(shuí)更具優(yōu)勢(shì)尚不清楚［14］。除以上蛋白和抗體類探針外，還有多肽類及小分子類探針也被用于不同成像模式中靶向PS的凋亡成像［18］。

2.靶向磷脂酰乙醇胺（PE）的分子探針：PE占細(xì)胞膜總磷脂的20%～40%，分布豐度較PS更高［16］。與PS類似，PE外化到細(xì)胞表面是凋亡早期標(biāo)志，可作為凋亡分子成像的理想靶點(diǎn)。有學(xué)者［19］設(shè)計(jì)了一種具有靶向PE的分子成像探針，通過(guò)巨噬細(xì)胞凋亡顯像來(lái)預(yù)測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊風(fēng)險(xiǎn)及易損性，顯示出良好的前景。Duramycin是由19個(gè)氨基酸組成的低分子量多肽，對(duì)PE敏感性高，靶向結(jié)合能力強(qiáng)，在輻射/化療誘導(dǎo)組織損傷、結(jié)直腸癌、乳腺癌及動(dòng)脈粥樣硬化等動(dòng)物模型中已有研究［20］，其具有極強(qiáng)的靶向凋亡細(xì)胞能力，且對(duì)腎臟的毒副作用低。但Duramycin尚未被用于超聲分子成像領(lǐng)域，具有一定的開(kāi)發(fā)空間。

3.靶向組蛋白（Histone）H1的分子探針：Histone H1是凋亡早期暴露于細(xì)胞表面的一種新的標(biāo)志物［14］。Lee等［21］開(kāi)發(fā)了一種高親和力的Histone H1結(jié)合肽，命名為ATPHH1，發(fā)現(xiàn)其在藥物誘導(dǎo)的腫瘤凋亡監(jiān)測(cè)中具有良好效果，且用量低于凋亡靶向肽-1（ApoPep-1）。ApoPep-1是由一種噬菌體展示技術(shù)鑒定而得，由6個(gè)氨基酸組成的短肽，分子量較小，以Ca2+非依賴方式靶向Histone H1，是一種理想的評(píng)價(jià)早期細(xì)胞凋亡的分子影像探針［21］。研究［22］表明，ApoPep-1對(duì)化療誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡檢測(cè)較AV更敏感。本課題組以ApoPep-1為分子探針設(shè)計(jì)了一種新的靶向納泡［23］，生物素化后的ApoPep-1分子量?jī)H為982 Da，較前期使用的AV-NBs穩(wěn)定性更好，在腫瘤組織內(nèi)存留時(shí)間更長(zhǎng)，極大地提高了靶向凋亡區(qū)的成像效果，為提高腫瘤治療反應(yīng)的評(píng)價(jià)能力提供了更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)，表明ApoPep-1作為凋亡分子成像探針具有極大優(yōu)勢(shì)。

4.靶向活化的Caspases-3/7的分子探針：Caspase是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中的半胱氨酸蛋白酶，在凋亡的啟動(dòng)和執(zhí)行中均具有關(guān)鍵作用［24］。Caspases-3/7是兩個(gè)重要的執(zhí)行酶，二者的激活是凋亡成像的理想靶點(diǎn)。由于凋亡細(xì)胞膜是完整的，因此，靶向Caspase 3/7的分子探針必須具有細(xì)胞膜通透性，才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)識(shí)別Caspase 3/7，這與靶向胞外凋亡標(biāo)志物如PS、PE和Histone H1等不同［14］。目前，已開(kāi)發(fā)的靶向活化Caspases-3/7的探針如WC-Ⅱ-89、WC-4-116、ICMT-11、ML-10、VAD-FMK、MICA-302、CP-18及C-SNAT等主要在PET中顯示出凋亡監(jiān)測(cè)能力［15，17］，其是否能用于超聲分子成像領(lǐng)域，尚需今后進(jìn)一步探索。

三、展望

目前，基于超聲分子成像評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡的研究尚處于早期研究階段，相較于MRI、PET、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像等凋亡成像研究，靶向凋亡的超聲分子探針還有極大的開(kāi)發(fā)空間。細(xì)胞凋亡過(guò)程涉及多個(gè)生物標(biāo)志物，篩選理想的超聲分子探針仍具有挑戰(zhàn)。未來(lái)，在發(fā)揮細(xì)胞凋亡不同生物標(biāo)志物的特性和優(yōu)勢(shì)的基礎(chǔ)上，開(kāi)展大量基礎(chǔ)研究工作，以充分發(fā)掘敏感性和特異性更高、對(duì)機(jī)體毒副作用更低的超聲分子成像探針，將為細(xì)胞凋亡超聲成像及腫瘤治療反應(yīng)的早期評(píng)估提供更多選擇。