杜功名，查欣欣，吳甜甜，陳劉陽，王洪雷

（1.江蘇恒生檢測有限公司，南京 210046；2.江蘇省農(nóng)藥研究所股份有限公司，南京 210046）

蕓苔素內(nèi)酯（Brassinolide）是一種高活性內(nèi)源植物生長調(diào)節(jié)劑，最早從油菜素甾醇類化合物（Brassinosteroids）中分離得到，屬于內(nèi)酯型甾體化合物[1]，其生物活性強(qiáng)，廣泛用于蔬菜、水果等作物生產(chǎn)，具有促進(jìn)生根、生長、受精，提苗壯苗，保花保果，促進(jìn)果實(shí)膨大、早熟，增強(qiáng)作物抗逆性等多重功能[2-5]。由于其在天然植物內(nèi)含量極低且提取工藝復(fù)雜，無法滿足實(shí)際生產(chǎn)需求，因此人工合成蕓苔素內(nèi)酯成為趨勢。

隨著蕓苔素內(nèi)酯等植物生長調(diào)節(jié)劑類農(nóng)藥用量增多及使用范圍日益擴(kuò)大，其安全性越來越受到關(guān)注。相關(guān)文獻(xiàn)報道指出，不同種類植物生長調(diào)節(jié)劑均具有生殖毒性[6]，部分還能夠增加腫瘤風(fēng)險[7]和影響心肌功能[8]等。當(dāng)前，測定蕓苔素內(nèi)酯的方法多為薄層色譜[9]、氣相色譜法[10]、高效液相色譜紫外檢測[11-14]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15]等，這些方法有些靈敏度不夠，有些方法繁瑣，而且均未涉及葡萄中28-表高蕓苔素內(nèi)酯的測定方法。本研究建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定葡萄中28-表高蕓苔素內(nèi)酯留量的方法，該方法簡便高效，靈敏度高，適合葡萄中28-表高蕓苔素內(nèi)酯殘留量的檢測，為葡萄中28-表高蕓苔素內(nèi)酯的殘留檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料：巨峰葡萄，于收獲期采收，由江蘇恒生檢測有限公司提供。

供試藥劑：28-表高蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.7%），上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與試劑

ACQUITY UPLC-Quattro ultima，美國沃特世科技公司；Shim-pack XR-ODSⅢC18（2.1 mm×50 mm，2.0μm），島津（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司；SQP天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；AL204天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；VORTEX MS3渦旋儀，萊普特科學(xué)儀器（北京）有限公司；H/T 16MM離心機(jī)，湖南赫西儀器設(shè)備有限公司；AM600瓶口分液器，螞蟻源科學(xué)儀器有限公司；KQ-600B超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；SHA-CA水浴恒溫振蕩器，上海江星儀器有限公司；ULTRAPURE（TYPE1）WATER純水儀，西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司。甲酸（分析純）、丙酮（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純），美國天地試劑公司；石墨化炭黑（GCB），江蘇南京化學(xué)試驗(yàn)有限公司；N-丙基乙二胺（SPA）、十八烷基硅烷（C18），上海安諾實(shí)驗(yàn)科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)樣品前處理

準(zhǔn)確稱取10.0 g葡萄樣品于50 mL離心管瓶中，加入15.0 mL甲醇，振蕩30 min，以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液于25 mL容量瓶，用甲醇定容。取1.0 mL定容液至裝有40 mg C18和40 mg PSA的1.5 mL離心管中，渦旋20 s后以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，過0.22μm濾膜，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶，待液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。

1.4 色譜和質(zhì)譜檢測條件

液相色譜條件：流速為0.2 mL/min；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為甲醇；柱箱溫度為30℃；進(jìn)樣量為1μL。恒流：0～3 min 90%B。

質(zhì)譜條件：電離源模式為ESI；電離源極性為負(fù)；脫溶劑氣體及流量為N2，600 L/h；碰撞氣及流量為Ar，0.25 mL/min；離子源溫度為110℃；脫溶劑氣溫度為400℃；毛細(xì)管電壓為3.5 kV。

28-表高蕓苔素內(nèi)酯的保留時間、母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量等參數(shù)見表1。

表1 28-表高蕓苔素內(nèi)酯質(zhì)譜參數(shù)

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取0.010 6 g 28-表高蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品，用丙酮進(jìn)行溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 057 mL/L的母液，用甲醇進(jìn)行稀釋成濃度為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，再用甲醇提取的葡萄基質(zhì)液進(jìn)行稀釋并配制成濃度分別為2、0.2、0.05、0.02、0.005 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.6 添加回收率試驗(yàn)

稱取葡萄空白樣品10.0 g置于50 mL離心管中，添加濃度分別為0.02、0.05、0.5 mg/kg，添加后進(jìn)行振蕩充分混勻，靜置30 min，將靜置后的樣品按照1.3的提取與凈化步驟和1.4的儀器條件進(jìn)行分析檢測，計算添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC-MS/MS條件的選擇

分別測試28-表高蕓苔素內(nèi)酯在ESI源正離子、ESI源負(fù)離子掃描方式下的信號強(qiáng)度，其中ESI源負(fù)離子溶劑效應(yīng)和基質(zhì)干擾較小。通過對錐孔電壓和碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，選擇493.45/142.73作為定量離子對，493.45/149.07作為定性離子對進(jìn)行監(jiān)測。28-表高蕓苔素內(nèi)酯色譜圖見圖1。

圖1 28-表高蕓苔素內(nèi)酯色譜圖

選擇甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相，采用相同液相條件對28-表高蕓苔素內(nèi)酯進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相時，28-表高蕓苔素內(nèi)酯響應(yīng)較高并且峰形更好。

2.2 提取條件的選擇

選擇甲醇、乙腈為提取劑，采用相同條件進(jìn)行提。結(jié)果表明，甲醇做提取劑時，28-表高蕓苔素內(nèi)酯響應(yīng)和回收率較高并且峰形更好。

2.3 凈化劑的選擇

葡萄樣品基質(zhì)中含有色素及糖類等雜質(zhì)，基質(zhì)較為復(fù)雜，因此凈化劑的選擇對后續(xù)的樣品檢測及整個實(shí)驗(yàn)結(jié)果尤為重要。實(shí)驗(yàn)對比了GCB＋PSA、GCB＋C18和PSA＋C183種凈化劑組合的凈化效果。結(jié)果顯示，GCB＋PSA、GCB＋C18為凈化劑進(jìn)行處理后得到的樣品添加回收率相對較低，PSA＋C18的凈化后得到的樣品添加回收率相對較好，且通過控制PSA和C18的質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)40 mg PSA＋40 mg C18起到較好的凈化效果，達(dá)到要求。

2.4 方法的線性關(guān)系

分別將配制的0.005、0.02、0.05、0.2、2 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按照濃度從低到高的順序進(jìn)行檢測，每個濃度重復(fù)3次。以其溶液濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在0.005～2 mg/L范圍內(nèi)，28-表高蕓苔素內(nèi)酯線性關(guān)系良好，得到28-表高蕓苔素內(nèi)酯的線性回歸方程為y=56 003.2x＋123.496，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 287，大于0.999。

2.5 回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

在葡萄基質(zhì)中進(jìn)行0.02、0.05及0.50 mg/kg 3個水平的添加回收率實(shí)驗(yàn)，每個處理重復(fù)5次。28-表高蕓苔素內(nèi)酯在葡萄中的添加回收率試驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，28-表高蕓苔素內(nèi)酯在葡萄中的平均回收率為78%～90%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.4%～7.3%，符合農(nóng)藥殘留檢測的要求。

表2 28-表高蕓苔素內(nèi)酯在葡萄中的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.6 方法定量限

以S/N≥10倍的信噪比對應(yīng)的濃度為方法的定量限，添加回收試驗(yàn)得出28-表高蕓苔素內(nèi)酯在葡萄上的定量限為0.02 mg/kg。

2.7 空白基質(zhì)效應(yīng)評價

取溶劑空白、基質(zhì)空白（葡萄）分別經(jīng)前處理后在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜上進(jìn)樣分析，溶劑空白、基質(zhì)空白（葡萄）在目標(biāo)峰位置的干擾峰響應(yīng)均滿足不超過30%定量限峰響應(yīng)的要求。

3 結(jié) 論

本研究建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定葡萄中28-表高蕓苔素內(nèi)酯殘留量的分析方法。葡萄樣品經(jīng)甲醇提取，PSA和C18凈化，UPLC-MS/MS測定。28-表高蕓苔素內(nèi)酯在葡萄中的平均回收率為78%～90%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.4%～7.3%。本方法操作簡單方便、高效準(zhǔn)確，適用于葡萄中28-表高蕓苔素內(nèi)酯的殘留檢測。