郭利軍　梁其干　范春節(jié)　鄧會棟　華敏　馮學杰　羅志文　陳哲

摘 要：為建立穩(wěn)定的農(nóng)桿菌介導的菠蘿遺傳轉(zhuǎn)化體系，以臺農(nóng)17號菠蘿幼嫩愈傷組織為試驗材料，以GUS基因瞬時表達率為遺傳轉(zhuǎn)化效果評價指標，應(yīng)用單因素試驗法，研究了卡那霉素對臺農(nóng)17號菠蘿愈傷組織不定芽分化的影響以及不同菌株、菌液濃度、共培養(yǎng)時間和乙酰丁香酮的添加等轉(zhuǎn)化相關(guān)因素對菠蘿遺傳轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果表明，80mg/L卡那霉素濃度可完全抑制不定芽分化，農(nóng)桿菌菌株采用LBA4404，菌液濃度OD600為0.8，共培養(yǎng)4d時遺傳轉(zhuǎn)化效果最佳，GUS基因瞬時表達率達到39.44%，而菌液中添加乙酰丁香酮未明顯提高GUS基因瞬時表達率。研究初步建立了農(nóng)桿菌介導的臺農(nóng)17號菠蘿遺傳轉(zhuǎn)化體系，為開展菠蘿關(guān)鍵基因功能驗證和品種改良搭建了遺傳轉(zhuǎn)化平臺。

關(guān)鍵詞：農(nóng)桿菌介導;臺農(nóng)17號菠蘿;遺傳轉(zhuǎn)化體系

中圖分類號 S667.8 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2021）21-0022-06

Abstract： In order to establish a stable agrobacterium-mediated genetic transformation system of pineapple， young callus of Tainong16 Pineapple was taken as experimental material， the effect of kanamycin on the callus differentiation and genetic transformation effect of agrobacterium strains， bacterial concentration， co-culture time， and addition of acetosyringone were studied by using single factor test method， the GUS gene transient expression rate was used as evaluation index of genetic transformation effect. Results showed that the concentration of kanamycin fully suppressing bud differentiation was 80 mg/L. The good results of genetic transformation effect with the 39.44% of the GUS gene transient expression rate can be obtained under the conditions of the agrobacterium strain using LBA4404， bacterial liquid concentration with an OD600 value of 0.8 and co-culture time for 4 days. The GUS gene transient expression rate was not significantly increased when acetosyringone was added into the bacterial fluid. It had been preliminarily established a system for agrobacterium-mediated transformation of Tainong17 pineapple， which provided a genetic transformation platform for functional verification of key genes and pineapple′s variety improvement.

Key words： Agrobacterium-mediated; Tainong17 pineapple; Genetic transformation system

菠蘿[Ananas comosus （L.） Merr.]為鳳梨科鳳梨屬植物，是華南地區(qū)重要的經(jīng)濟作物。2006年起課題組開展了包括乙烯誘導菠蘿催花等在內(nèi)的一系列技術(shù)研發(fā)工作，目前已克隆LEAFY[1]、FT[2]、TCP[3]、COL[4]等多個參與花芽分化的基因。臺農(nóng)17號菠蘿是從眾多菠蘿種質(zhì)資源中篩選出的優(yōu)良品種，根據(jù)受乙烯誘導開花的程度，將其劃為乙烯誘導開花鈍感型品種，它是研究菠蘿開花機理的優(yōu)異材料。然而，菠蘿遺傳轉(zhuǎn)化體系的缺失嚴重阻礙了乙烯誘導菠蘿開花機制的研究，為了實現(xiàn)開花鈍感型和敏感型的互相轉(zhuǎn)換，驗證花芽分化關(guān)鍵基因功能，從分子水平闡明菠蘿開花機理，建立臺農(nóng)17號菠蘿遺傳轉(zhuǎn)化體系平臺就顯得非常必要。

農(nóng)桿菌介導法具有易操作、低拷貝、遺傳穩(wěn)定性強等特點，被廣泛應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因研究[5]。目前，菠蘿轉(zhuǎn)基因研究普遍采用農(nóng)桿菌介導法，遺傳轉(zhuǎn)化對象主要集中在神灣、皇后等皇后類菠蘿上[6-8]。已有研究表明，不同菠蘿品種間的遺傳轉(zhuǎn)化參數(shù)有著較大的不同，甚至同一菠蘿品種也存在一定差別[9]。目前，有關(guān)臺農(nóng)系列菠蘿遺傳轉(zhuǎn)化研究鮮有報道，為此，本研究就影響農(nóng)桿菌介導臺農(nóng)17號菠蘿遺傳轉(zhuǎn)化效率的相關(guān)因素，包括卡那霉素對愈傷組織不定芽分化的影響以及不同菌株、菌液濃度、共培養(yǎng)時間和乙酰丁香酮的添加等，對菠蘿遺傳轉(zhuǎn)化的影響進行了探討，以期為建立穩(wěn)定的臺農(nóng)17號菠蘿遺傳轉(zhuǎn)化體系提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與條件 將臺農(nóng)17號菠蘿組培增殖單芽置于MS+6-BA 3mg/L+NAA 2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH 5.8培養(yǎng)基中，在溫度28℃、黑暗條件下培養(yǎng)30d左右，即可產(chǎn)生大量幼嫩愈傷組織。將幼嫩愈傷組織切成0.5cm左右的小塊作為開展遺傳轉(zhuǎn)化因素優(yōu)化試驗材料，黑暗條件下置于再生培養(yǎng)基上進行預培養(yǎng)和共培養(yǎng)，培養(yǎng)基為MS+6-BA 2mg/L+NAA 1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH 5.8。農(nóng)桿菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，具體為，蛋白胨10g/L+酵母浸膏5g/L+氯化鈉10g/L+卡那霉素50mg/L+利福平10mg/L+瓊脂12g/L，pH 5.8;培養(yǎng)基在0.11 MPa壓力下，121℃滅菌16min后冷卻待用。菌株由中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所提供，菌株內(nèi)含有攜帶NOS啟動子、CaMV35S啟動子、NOS終止子、NPTⅡ基因和GUS基因的載體質(zhì)粒pBI121（圖1）。

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圖1 質(zhì)粒pBI121酶切和結(jié)構(gòu)圖譜

取-75℃凍存的農(nóng)桿菌菌株，在冰上解凍后劃平板活化培養(yǎng)3d。挑取單菌落于4mL液體LB培養(yǎng)基中，在180r/min轉(zhuǎn)速搖床過夜培養(yǎng)。當菌液OD600值達到0.2后，按照1∶40（v/v）比例接入新鮮LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至指定濃度，2810×g離心8min，再用等量的液體再生培養(yǎng)基重懸菌體用于后期侵染。

6-BA（產(chǎn)品編號A600743，純度≥98%）、NAA（產(chǎn)品編號A600729，純度≥98%）、DMSO（產(chǎn)品編號A503039，純度≥99%）、乙酰丁香酮（產(chǎn)品編號A601111，純度≥98%）、卡那霉素（產(chǎn)品編號A506636，純度為USP Grade），利福平（產(chǎn)品編號A600812，純度為USP Grade）等試劑均購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 遺傳轉(zhuǎn)化基本條件 研究主要針對卡那霉素對愈傷組織再生的影響以及不同農(nóng)桿菌菌株、菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間以及乙酰丁香酮的添加等影響遺傳轉(zhuǎn)化影響因子開展相關(guān)試驗，以GUS基因瞬時表達率作為評價遺傳轉(zhuǎn)化效果指標[10]。遺傳轉(zhuǎn)化基本條件為：黑暗條件下預培養(yǎng)3d，菌液濃度OD600值0.5時侵染愈傷組織30min，將愈傷組織接種至共培養(yǎng)基暗培養(yǎng)3d，參照Jefferson等[11]的方法，對共培養(yǎng)結(jié)束的愈傷組織進行染色，統(tǒng)計染色率。遺傳轉(zhuǎn)化因素優(yōu)化試驗采用逐步優(yōu)化法進行，每因素試驗優(yōu)化的結(jié)果將作為下一因素試驗的條件。

1.3 遺傳轉(zhuǎn)化因素的優(yōu)化試驗

1.3.1 卡那霉素 設(shè)置不同濃度卡那霉素以測試臺農(nóng)17號菠蘿愈傷組織的卡那霉素本底抗性?？敲顾貪舛葹?、10、20、30、40、50、60、80mg/L，統(tǒng)計再生率，稱量愈傷組織重量，評價卡那霉素對愈傷組織再生的影響。

1.3.2 農(nóng)桿菌菌株 采用GV3101、LBA4404、AGL1和EHA105等4種不同菌株，參照遺傳轉(zhuǎn)化基本條件，待共培養(yǎng)結(jié)束后，統(tǒng)計不同菌株侵染條件下的GUS基因瞬時表達率。

1.3.3 菌液濃度 菌液濃度OD600設(shè)置為0.2、0.4、0.6、0.8，采用1.3.2篩選出的農(nóng)桿菌菌株，其他試驗條件參照遺傳轉(zhuǎn)化基本條件，待共培養(yǎng)結(jié)束后，統(tǒng)計不同菌液濃度條件下的GUS基因瞬時表達率。

1.3.4 共培養(yǎng)時間 將侵染后的愈傷組織置于共培養(yǎng)基上，分別培養(yǎng)1、2、3、4 d，采用1.3.2和1.3.3篩選出的結(jié)果，其他試驗條件參照遺傳轉(zhuǎn)化基本條件，待共培養(yǎng)結(jié)束后，統(tǒng)計不同共培養(yǎng)天數(shù)條件下的GUS基因瞬時表達率。

1.3.5 菌液添加乙酰丁香酮 培養(yǎng)農(nóng)桿菌至指定濃度，用等量的液體再生培養(yǎng)基重懸菌體后，在菌液中分別添加0、50、100、200mg/L等4種不同濃度乙酰丁香酮，采用1.3.2、1.3.3和1.3.4篩選出的結(jié)果，其他試驗條件參照遺傳轉(zhuǎn)化基本條件，待共培養(yǎng)結(jié)束后，統(tǒng)計不同乙酰丁香酮濃度條件下的GUS基因瞬時表達率。

1.4 評價指標與數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

1.4.1 評價指標 相關(guān)公式如下：

卡那霉素對愈傷組織再生的影響試驗評價指標為再生率，再生率（%）=[出芽的愈傷組織數(shù)量愈傷組織總數(shù)量]×100;

遺傳轉(zhuǎn)化評價效果指標為GUS基因瞬時表達率，GUS基因瞬時表達率（%）=[被染藍的愈傷組織數(shù)量愈傷組織總數(shù)量]×100

1.4.2 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 按照郭利軍等的方法，將愈傷組織重量值進行平方根轉(zhuǎn)化SQRT（X），再生率和GUS基因瞬時表達率值經(jīng)平方根后反正弦化ASIN（SQRT（X）），采用IBM SPSS Statistics 22軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與方差分析（ANOVA）和Duncan′s多重比較[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 卡那霉素對愈傷組織再生的影響 試驗結(jié)果表明，隨著卡那霉素濃度的升高，再生率和愈傷組織重量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，卡那霉素對愈傷組織的增殖和再生產(chǎn)生了顯著影響（表1、圖2）。從再生率指標來看，隨著卡那霉素濃度的升高，再生率從最高的87.66%逐步下降至0%。與0～40mg/L 5個處理比較，當卡那霉素濃度達到50mg/L時，其再生率從87.66%顯著下降至35.98%;而達到60～80mg/L時，其再生率大幅下降至0%～8.89%。從愈傷組織重量指標來看，卡那霉素濃度達到50mg/L后，重量值為0.38g，顯著低于0～40mg/L5個處理水平值;達到60～80mg/L后，重量值降為0.24～0.28g，達到最低水平值。所以進行菠蘿轉(zhuǎn)化芽篩選時，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的愈傷組織材料培養(yǎng)初期卡那霉素濃度可選擇50mg/L，隨著愈傷組織的逐漸分化和再生，卡那霉素濃度可再逐步從60mg/L提高至80mg/L，以最大程度降低假陽性百分率和轉(zhuǎn)基因芽的逃逸率。

2.2 農(nóng)桿菌菌株對遺傳轉(zhuǎn)化的影響 比較不同農(nóng)桿菌菌株GV3101、LBA4404、AG1和EHA105對遺傳轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果顯示，不同農(nóng)桿菌菌株的GUS基因瞬時表達率存在顯著差異（表2）。其中，GV3101和LBA4404的GUS基因瞬時表達率顯著高于AG1和EHA105。雖然GV3101和LBA4404的GUS基因瞬時表達率無明顯差別，但LBA4404的GUS基因瞬時表達率達到26.67%，高于GV3101，所以研究選擇LBA4404作為介導遺傳轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株。

2.3 菌液濃度對遺傳轉(zhuǎn)化的影響 試驗結(jié)果表明，不同菌液濃度間的GUS基因瞬時表達率存在顯著差別（表3）。隨著菌液濃度的增高，GUS基因瞬時表達率從11.11%逐步提高至35.56%，當菌液濃度OD600值達到0.6時，GUS基因瞬時表達率達到32.22%，與OD600值為0.8對應(yīng)的GUS基因瞬時表達率35.56%已無明顯差異，所以O(shè)D600值0.6～0.8是適合遺傳轉(zhuǎn)化的菌液濃度，本研究選用GUS基因瞬時表達率稍高的OD600值0.8作為下一步試驗的菌液濃度。

2.4 共培養(yǎng)時間對遺傳轉(zhuǎn)化的影響 不同共培養(yǎng)時間條件下，GUS基因瞬時表達率存在顯著差異，并且隨著共培養(yǎng)時間的延長，GUS基因瞬時表達率逐漸增高，當共培養(yǎng)時間達到3d后，GUS基因瞬時表達率達到38.65%，與共培養(yǎng)4d的GUS基因瞬時表達率39.44%無顯著差別（表4）。所以本研究選擇表達率稍高的4d處理作為共培養(yǎng)時間條件。

2.5 菌液添加乙酰丁香酮對遺傳轉(zhuǎn)化的影響 菌液中添加乙酰丁香酮似乎對遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了不利影響。雖然100mg/L處理GUS基因瞬時表達率38.02%高于對照的36.34%，但與對照相比，100mg/L處理并未顯著提高GUS基因瞬時表達率。而添加50mg/L和200mg/L 2個處理的GUS基因分別為29.54%、23.64%，與對照相比，也未明顯提高GUS基因瞬時表達率，反而產(chǎn)生了抑制作用（表5）。本著降低試驗成本的原則，所以菌液中不再添加乙酰丁香酮。

3 結(jié)論與討論

本研究以誘導的幼嫩愈傷組織為試驗材料，采用農(nóng)桿菌介導法，針對相關(guān)遺傳轉(zhuǎn)化因素開展了系列優(yōu)化試驗。結(jié)果表明，卡那霉素達到80mg/L時可完全抑制不定芽分化，農(nóng)桿菌菌株采用LBA4404，菌液濃度OD600為0.8，共培養(yǎng)4d時遺傳轉(zhuǎn)化效果最佳，GUS基因瞬時表達率達到39.44%，而菌液中添加乙酰丁香酮未明顯提高GUS基因瞬時表達率。研究初步建立了農(nóng)桿菌介導的臺農(nóng)17號菠蘿遺傳轉(zhuǎn)化體系，為開展菠蘿關(guān)鍵基因定向編輯、功能驗證和品種改良搭建了遺傳轉(zhuǎn)化平臺。

預試驗發(fā)現(xiàn)，采用培養(yǎng)30d左右較為幼嫩的愈傷組織材料，可取得較好的瞬時表達效果，而愈傷組織培養(yǎng)不足20d或者大于50d遺傳轉(zhuǎn)化效果相對較差，這與神灣菠蘿愈傷組織SERK1基因5′上游調(diào)控序列啟動子活性的瞬時表達分析結(jié)果是高度一致的[13];農(nóng)桿菌介導荔枝遺傳轉(zhuǎn)化研究也證明，愈傷組織繼代培養(yǎng)不同時間會對GUS基因瞬時表達效果產(chǎn)生顯著影響，其認為繼代培養(yǎng)15d的胚性愈傷組織處于最旺盛分裂的時期，易于接受外源DNA[14]。所以開展菠蘿遺傳轉(zhuǎn)化研究，建議選用旺盛分裂時期的幼嫩愈傷組織作為侵染材料，避免選擇老化的愈傷組織。

巴厘菠蘿采用濃度為50mg/L的卡那霉素篩選轉(zhuǎn)化菠蘿植株[15]，皇后菠蘿采用濃度為100mg/L的卡那霉素篩選轉(zhuǎn)化菠蘿植株[16-18]，神灣菠蘿卡那霉素采用20mg/L作為初步篩選濃度，再生階段采用30～50mg/L的卡那霉素[19]。本研究建議臺農(nóng)17號菠蘿早期卡那霉素選擇50mg/L，隨著愈傷組織的分化，可逐步提高至60mg/L，至再生階段可提高至80mg/L。同時，以上研究結(jié)果也表明，不同菠蘿品種的卡那霉素本底抗性有所不同，其采用的卡那霉素篩選策略也有所不同。產(chǎn)生這種差異的原因可能是：（1）不同菠蘿品種遺傳背景不同，各自擁有不同的卡那霉素本底抗性水平;（2）在經(jīng)歷長時期繼代培養(yǎng)后，無性繁殖材料可能存在生理和遺傳上的變異[20]，導致卡那霉素抗性水平發(fā)生變化。所以基于不同的試驗和材料培養(yǎng)條件，開展卡那霉素抗性試驗是非常必要的。

目前，國內(nèi)外菠蘿遺傳轉(zhuǎn)化研究多采用農(nóng)桿菌介導法，但所采用的農(nóng)桿菌菌株、菌液濃度和共培養(yǎng)時間均有一定差別。同是以葉片基部0.5～1cm的部分作為農(nóng)桿菌侵染材料，皇后菠蘿采用的是將過夜培養(yǎng)的EHA105菌株稀釋10～20倍，共培養(yǎng)3d[18]，無刺卡因菠蘿采用的是農(nóng)桿菌菌株C58PmP90、EHA101和LBA4404，OD600為1.4～1.6，共培養(yǎng)2d[7];這表明，不同菠蘿品種同一侵染部位的材料，其所采用的遺傳轉(zhuǎn)化參數(shù)是有所差別的。

同是以神灣菠蘿葉基誘導的愈傷組織為農(nóng)桿菌侵染材料，Ma等[19]等采用的農(nóng)桿菌菌株是LBA4404，OD600為1，共培養(yǎng)3d;Luan等[13]采用的農(nóng)桿菌菌株是GV3101，OD600為0.5，共培養(yǎng)2d;同是以無刺卡因菠蘿愈傷組織為侵染材料，Espinosa等[21]采用的是LBA4404和AT2260，其OD600值為10（按照[22]關(guān)于OD600值為0.1相當于農(nóng)桿菌菌株1×107 cfu/ml的標準），共培養(yǎng)時間為1d，而Firoozabady等[8]采用的是農(nóng)桿菌菌株是GV3101，OD600值為2～3，共培養(yǎng)3d;這表明，即使是同一菠蘿品種同種侵染材料，其采用的遺傳轉(zhuǎn)化參數(shù)也存在較大不同。

本研究以臺農(nóng)17號菠蘿幼嫩愈傷組織為侵染對象，采用農(nóng)桿菌菌株LBA4404，菌液濃度OD600為0.8，共培養(yǎng)時間設(shè)置3d開展遺傳轉(zhuǎn)化研究，與上述菠蘿品種所采用的參數(shù)有所不同，進一步驗證不同菠蘿品種間遺傳轉(zhuǎn)化參數(shù)是不完全一致的，也說明了開展本研究的必要性。

據(jù)報道，菌液中添加乙酰丁香酮能夠顯著誘導增強農(nóng)桿菌的侵染活力[23]，而本研究于菌液中添加乙酰丁香酮，GUS基因瞬時表達率并未明顯提高，這與[24]的研究結(jié)果相符。分析產(chǎn)生這種情況的原因，一方面可能是添加50mg/L的乙酰丁香酮濃度過高所致。有報道，菌液中添加20mg/L乙酰丁香酮會抑制遺傳轉(zhuǎn)化，降低GUS基因染色率[25，26];另一方面可能與溶解乙酰丁香酮的有機溶劑二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）有關(guān)。農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化研究普遍采用DMSO溶解乙酰丁香酮[27，28]，所以本研究也同樣采用DMSO溶解乙酰丁香酮。而DMSO對細胞膜具有很強的親和力，可協(xié)助脂溶性藥物透過細胞膜，但DMSO超過一定濃度對神經(jīng)細胞株P(guān)C12有害，對細胞的生長會產(chǎn)生不利影響[29]。同時，DMSO還有抑制大腸桿菌生長和繁殖的作用[30]，所以未能有效促進遺傳轉(zhuǎn)化效果的原因可能是DMSO對愈傷組織細胞和農(nóng)桿菌細胞產(chǎn)生了毒害和抑制作用，雖然乙酰丁香酮能夠增強農(nóng)桿菌的侵染活力，但其誘導的侵染活力程度不足以抵消DMSO所產(chǎn)生的傷害。

共培養(yǎng)基中添加磷酸甜菜堿和脯氨酸等滲透保護劑可提高農(nóng)桿菌介導的李和蘋果的遺傳轉(zhuǎn)化效率[31]，下一步擬調(diào)整乙酰丁香酮溶劑，同時在菌液和共培養(yǎng)基中應(yīng)用磷酸甜菜堿和脯氨酸等滲透保護劑，進一步優(yōu)化相關(guān)參數(shù)提高遺傳轉(zhuǎn)化效率，為開展目標基因的定向編輯提供高效平臺支撐。

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（責編：張宏民）