陳靜 胡進(jìn)靜 李汛,,3,4,5 王海平 張璐
(1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730000; 2.甘肅省生物治療與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730000;3.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院普外科,甘肅 蘭州 730000;4.蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤防治中心,甘肅 蘭州 730000;5.甘肅省肝膽胰外科研究所,甘肅 蘭州 730000)
肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率及死亡率高[1]。由于肝癌早期發(fā)病隱匿,臨床表現(xiàn)不明顯,確診時(shí)已是晚期[2]。肝癌的發(fā)生和發(fā)展與腫瘤抑制基因的丟失和癌基因的激活有關(guān)[3]。目前尚不清楚其潛在的分子機(jī)制。因此,迫切需要探索具有高特異性和敏感性的有效生物標(biāo)志物用于肝癌的診斷和預(yù)后,從而改善肝癌的生存率。著絲粒蛋白U(Centromere protein U,CENPU)是2004年首次發(fā)現(xiàn)的一種著絲粒結(jié)合蛋白,是著絲粒-動(dòng)粒復(fù)合體(Centromere kinetochore complex,CKC)重要組成部分,若其發(fā)生異?;蛉狈?huì)導(dǎo)致CKC結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生變化,染色體不穩(wěn)定性增加,導(dǎo)致基因組突變,從而引起腫瘤的發(fā)生[4-5]。目前越來越多的研究表明,CENPU表達(dá)的異常是許多腫瘤共有的特征,其可在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá),參與腫瘤的增殖、遷移、侵襲及凋亡等過程,其高表達(dá)與惡性腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)[6-15]。但關(guān)于CENPU在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中的作用未知。本研究首先通過TCGA數(shù)據(jù)庫預(yù)測CENPU在HCC患者中表達(dá)情況及其與HCC患者預(yù)后的關(guān)系,進(jìn)一步通過免疫組化驗(yàn)證CENPU蛋白表達(dá)水平與肝癌的關(guān)系及對預(yù)后的影響,以評價(jià)CENPU是否可作為監(jiān)測HCC患者預(yù)后標(biāo)志物的價(jià)值。
1.1 一般資料 收集2010~2012年在蘭州大學(xué)第一醫(yī)院行肝腫瘤切除術(shù)并經(jīng)病理證實(shí)為肝細(xì)胞肝癌的患者中選擇80例患者的臨床病理特征相關(guān)數(shù)據(jù),包括年齡、性別、肝功能、Child-Pugh分級、腫瘤大小、分化程度、包膜、淋巴結(jié)受累、血管侵犯、治療方案等。納入標(biāo)準(zhǔn):所有患者術(shù)前和術(shù)后復(fù)發(fā)前未行化療、放療、介入治療、消融治療或靶向治療,影像學(xué)檢查結(jié)果確定有無轉(zhuǎn)移、腫瘤位置,術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)為原發(fā)性HCC。排除標(biāo)準(zhǔn):繼發(fā)性肝細(xì)胞癌、合并其他慢性疾病者等。并對于納入患者的基線特征進(jìn)行表述并與人群特征進(jìn)行比較,確認(rèn)納入患者與人群的臨床病理特征無顯著性差異。所有患者在研究前均已簽署知情同意書。所有患者均經(jīng)隨訪至患者死亡。該研究獲得蘭州大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),根據(jù)機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)的規(guī)程,每位患者均獲得了知情同意。研究方案符合1975年《赫爾辛基宣言》的道德準(zhǔn)則。
1.2 數(shù)據(jù)下載 研究中使用的529例肝癌患者(其中有371例癌組織和50例正常組織)CENPU基因測序信息及臨床信息來源于UALCAN在線數(shù)據(jù)庫(數(shù)據(jù)來源于TCGA數(shù)據(jù)庫),比較兩種組織中CENPU mRNA表達(dá)量的差別。同時(shí),根據(jù)RNA seq數(shù)據(jù),以CENPU mRNA表達(dá)量的中位數(shù)為界將肝細(xì)胞癌分為高表達(dá)與低表達(dá)兩組,Kaplan-Meier法繪制生存曲線,總生存時(shí)間從疾病診斷開始計(jì)算至患者死亡。無病生存率分析CENPU對肝癌患者的預(yù)后價(jià)值。
1.3 免疫組化 石蠟切片脫蠟和水化后,用PBS(pH7.4)沖洗3次,每次3 min微波爐對組織抗原進(jìn)行修復(fù),具體步驟按照文獻(xiàn)操作[16]??贵w(Gene Tex,Cat No.GTX48708)。免疫組化結(jié)果均由2位病理醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行評估,以保證結(jié)果的真實(shí)性。CENPU為細(xì)胞漿及胞核著色,評分采用陽性細(xì)胞比例方法:0分<5%;1分6%~35%;2分36%~70%;3分> 70%。為了進(jìn)一步明確CENPU蛋白表達(dá)水平與HCC患者的臨床病理特征之間的相關(guān)性,根據(jù)CENPU蛋白的表達(dá)量進(jìn)行分組,高表達(dá)(2分或者3分),低表達(dá)(0分或則1分),見圖1。
圖1 肝癌組織中CENPU的代表性免疫染色圖片
2.1 CENPU mRNA在肝癌組織中表達(dá)情況 CENPU mRNA在HCC患者肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常肝組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001),見圖2A;且在HCC患者,按不同病理分期分為4組,病理分級采用Edmondson-Stein方法,CENPU的mRNA在肝癌組織中的表達(dá)量隨著病例分級逐次遞增,見圖2B。
圖2 在UALCAN數(shù)據(jù)庫分析CENPU mRNA表達(dá)情況
2.2 HCC組織中CENPU蛋白與臨床病理特征的關(guān)系 CENPU的蛋白表達(dá)量與腫瘤患者年齡、性別、病理分級、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、肝硬化結(jié)節(jié)的數(shù)目、腫瘤包膜是否完整、腫瘤的分期及分級、是否具有HBsAb、是否感染HBV及HCV、生化指標(biāo)均無關(guān)系(P>0.05),見表1。
表1 CENPU不同表達(dá)量與臨床病理指標(biāo)相關(guān)性分析
2.3 CENPU蛋白在HCC患者中表達(dá)與患者生存期的關(guān)系 首先通過GEPIA在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析顯示,生存曲線結(jié)果顯示低表達(dá)組總生存期(OS)以及無瘤生存期(DFS)顯著高于高表達(dá)組(P<0.05),見圖3。根據(jù)TCGA的數(shù)據(jù)結(jié)果初步可知CENPU在HCC患者的高低表達(dá)可作為HCC患者的與肝癌患者的預(yù)后具有一定的相關(guān)性。前述免疫組化染色強(qiáng)度評分方法,有7.6%(6/79)的HCC組織顯示陰性(0分),38%(30/79)的HCC組織顯示弱陽性(1分),40.5%(32/79)的HCC組織中顯示中度染色(2分),13.9%(11/79)的HCC組織呈現(xiàn)強(qiáng)陽性(3分)。在79例病理組織中低表達(dá)人數(shù)有36例(45.6%),高表達(dá)有43例(54.4%),比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.072)。CENPU蛋白在肝癌中高表達(dá)組患者的總生存期低于低表達(dá)組患者的生存期(P=0.023),見圖4。但CENPU蛋白的高低表達(dá)與HCC患者的無瘤進(jìn)展期無相關(guān)性(P=0.184)。
圖3 肝癌患者中CENPU的mRNA上調(diào)與預(yù)后不良有關(guān)
圖4 基于CENPU蛋白表達(dá)水平的HCC患者生存曲線
2.4 肝癌總生存率預(yù)后指標(biāo)的單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析 進(jìn)一步采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸進(jìn)行單因素分析發(fā)現(xiàn),CENPU表達(dá)水平、病理分期、GGT是HCC患者總生存期的危險(xiǎn)因素。多因素分析顯示,CENPU表達(dá)水平、病理分期、GGT顯示是影響HCC患者總生存期的因素,見表2。
表2 肝癌總生存率預(yù)后指標(biāo)的單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析
肝癌為發(fā)病率和死亡率都極高的惡性腫瘤,近年來從發(fā)病危險(xiǎn)因素分析到早期診斷、療效監(jiān)測和預(yù)后評估的分子標(biāo)志物的尋找,再到放化療耐藥機(jī)制的探討,以及靶向藥物的研發(fā)成為了研究的熱點(diǎn),并且取得了一定的進(jìn)展[17-19]。HCC的發(fā)生、發(fā)展主要由復(fù)雜的遺傳因素(遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素、基因變異等)和環(huán)境因素協(xié)同作用,共同促進(jìn)肝炎-肝硬化-肝癌的轉(zhuǎn)變效應(yīng)[20]。因此找到預(yù)測患者預(yù)后的指標(biāo),亦或者尋找潛在的治療靶點(diǎn),是有效提高肝癌患者生存期的途徑。
課題組前期通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)方法研究肝細(xì)胞癌(HCC)中肝癌干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性[21]。我們通過進(jìn)一步的篩選發(fā)現(xiàn)CENPU與肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。CENPU是一種著絲粒結(jié)合蛋白,在整個(gè)細(xì)胞周期中都被定位在著絲粒中,被確認(rèn)為著絲粒的組成成分,在細(xì)胞周期進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。CENPU基因在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá),其在多種癌癥中過表達(dá)與腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān),但在肝癌中尚無關(guān)于其與患者預(yù)后影響的相關(guān)研究,遂本實(shí)驗(yàn)展開了相關(guān)研究,以期了解CENPU是否是影響HCC患者預(yù)后的因素,是否可以作為監(jiān)測HCC患者不良預(yù)后的指標(biāo)。
本研究首先通過UALCAN在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測其mRNA水平高表達(dá)與HCC患者不良預(yù)后相關(guān),提示其可能作為一種促癌基因參與到肝癌的進(jìn)展中,導(dǎo)致疾病的進(jìn)展,從而降低患者生存期。這與膀胱癌、腔內(nèi)乳腺癌組織中的結(jié)果相一致[11,22],CENPU較鄰近的正常組織表達(dá)顯著上調(diào),并且CENPU高表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān)[12,23]。Wan等[24]通過基于生物信息學(xué)的分析鑒定CENPU是與肝細(xì)胞癌相關(guān)的新基因,其可能為監(jiān)測肝細(xì)胞癌的一種潛在標(biāo)志物,而在此前是否參與致癌作用,需要進(jìn)一步的分子生物學(xué)來探討其參與肝癌的分子機(jī)制。Wang等[25]在探索具有可能用作血清/血漿生物標(biāo)志物的新型circRNA及其在肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)病機(jī)理中發(fā)現(xiàn)CENPU是肝癌不良預(yù)后的指標(biāo)。
本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用免疫組織化學(xué)染色法驗(yàn)證CENPU在蛋白水平上表達(dá)情況。通過比較CENPU表達(dá)量與肝癌患者的臨床資料,發(fā)現(xiàn)其與患者的年齡、性別、病理分級、腫瘤大小及數(shù)目、AFP的表達(dá)量、腫瘤包膜是否完整、是否感染HBV及HCV以及生化指標(biāo)等臨床基本特征均不相關(guān)。由于本研究標(biāo)本數(shù)量較少,具有一定的偏倚性,所以需要進(jìn)一步多中心、大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。而通過Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn),HCC組織中高表達(dá)CENPU患者總體生存率均顯著低于低表達(dá)者,表明HCC患者組織中CENPU表達(dá)水平和臨床預(yù)后緊密相關(guān),有望應(yīng)用到臨床上通過監(jiān)測該指標(biāo),為患者預(yù)后評估予以一定的指導(dǎo)。Yang等[10]發(fā)現(xiàn)CENPU基因?qū)?xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)程的影響,CENPU的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小有關(guān)。本研究中通過Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸單因素和多因素分析結(jié)果表明,CENPU表達(dá)水平、患者的病理分期、GGT指標(biāo)可作為影響HCC患者總生存期的危險(xiǎn)因素。本研究存在不足之處:其一,本次收集的樣本量較少,需要加大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證;其二,未進(jìn)行與正?;颊吒谓M織標(biāo)本進(jìn)行比較,無法證實(shí)肝癌患者正常肝組織CENPU的表達(dá)量;其三,未進(jìn)行相關(guān)分子生物水平上的機(jī)制研究,所以需要進(jìn)一步研究CENPU在肝癌中具體機(jī)制以更好地指導(dǎo)其臨床應(yīng)用。
CENPU在HCC中表達(dá)明顯升高,與患者的病理分期、GGT指標(biāo)相關(guān),且其高表達(dá)者生存期降低,可能是影響肝癌患者不良預(yù)后的一個(gè)因素及治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。