陳靜 胡進(jìn)靜 李汛,,3,4,5 王海平 張璐

(1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省生物治療與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院普外科，甘肅 蘭州 730000；4.蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤防治中心，甘肅 蘭州 730000；5.甘肅省肝膽胰外科研究所，甘肅 蘭州 730000)

肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及死亡率高[1]。由于肝癌早期發(fā)病隱匿，臨床表現(xiàn)不明顯，確診時(shí)已是晚期[2]。肝癌的發(fā)生和發(fā)展與腫瘤抑制基因的丟失和癌基因的激活有關(guān)[3]。目前尚不清楚其潛在的分子機(jī)制。因此，迫切需要探索具有高特異性和敏感性的有效生物標(biāo)志物用于肝癌的診斷和預(yù)后，從而改善肝癌的生存率。著絲粒蛋白U(Centromere protein U，CENPU)是2004年首次發(fā)現(xiàn)的一種著絲粒結(jié)合蛋白，是著絲粒-動(dòng)粒復(fù)合體(Centromere kinetochore complex，CKC)重要組成部分，若其發(fā)生異?；蛉狈?huì)導(dǎo)致CKC結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生變化，染色體不穩(wěn)定性增加，導(dǎo)致基因組突變，從而引起腫瘤的發(fā)生[4-5]。目前越來(lái)越多的研究表明，CENPU表達(dá)的異常是許多腫瘤共有的特征，其可在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，參與腫瘤的增殖、遷移、侵襲及凋亡等過(guò)程，其高表達(dá)與惡性腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)[6-15]。但關(guān)于CENPU在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中的作用未知。本研究首先通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)CENPU在HCC患者中表達(dá)情況及其與HCC患者預(yù)后的關(guān)系，進(jìn)一步通過(guò)免疫組化驗(yàn)證CENPU蛋白表達(dá)水平與肝癌的關(guān)系及對(duì)預(yù)后的影響，以評(píng)價(jià)CENPU是否可作為監(jiān)測(cè)HCC患者預(yù)后標(biāo)志物的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010～2012年在蘭州大學(xué)第一醫(yī)院行肝腫瘤切除術(shù)并經(jīng)病理證實(shí)為肝細(xì)胞肝癌的患者中選擇80例患者的臨床病理特征相關(guān)數(shù)據(jù)，包括年齡、性別、肝功能、Child-Pugh分級(jí)、腫瘤大小、分化程度、包膜、淋巴結(jié)受累、血管侵犯、治療方案等。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者術(shù)前和術(shù)后復(fù)發(fā)前未行化療、放療、介入治療、消融治療或靶向治療，影像學(xué)檢查結(jié)果確定有無(wú)轉(zhuǎn)移、腫瘤位置，術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)為原發(fā)性HCC。排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性肝細(xì)胞癌、合并其他慢性疾病者等。并對(duì)于納入患者的基線(xiàn)特征進(jìn)行表述并與人群特征進(jìn)行比較，確認(rèn)納入患者與人群的臨床病理特征無(wú)顯著性差異。所有患者在研究前均已簽署知情同意書(shū)。所有患者均經(jīng)隨訪(fǎng)至患者死亡。該研究獲得蘭州大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，根據(jù)機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)的規(guī)程，每位患者均獲得了知情同意。研究方案符合1975年《赫爾辛基宣言》的道德準(zhǔn)則。

1.2 數(shù)據(jù)下載 研究中使用的529例肝癌患者(其中有371例癌組織和50例正常組織)CENPU基因測(cè)序信息及臨床信息來(lái)源于UALCAN在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(數(shù)據(jù)來(lái)源于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù))，比較兩種組織中CENPU mRNA表達(dá)量的差別。同時(shí)，根據(jù)RNA seq數(shù)據(jù)，以CENPU mRNA表達(dá)量的中位數(shù)為界將肝細(xì)胞癌分為高表達(dá)與低表達(dá)兩組，Kaplan-Meier法繪制生存曲線(xiàn)，總生存時(shí)間從疾病診斷開(kāi)始計(jì)算至患者死亡。無(wú)病生存率分析CENPU對(duì)肝癌患者的預(yù)后價(jià)值。

1.3 免疫組化 石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS(pH7.4)沖洗3次，每次3 min微波爐對(duì)組織抗原進(jìn)行修復(fù)，具體步驟按照文獻(xiàn)操作[16]?？贵w(Gene Tex，Cat No.GTX48708)。免疫組化結(jié)果均由2位病理醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行評(píng)估，以保證結(jié)果的真實(shí)性。CENPU為細(xì)胞漿及胞核著色，評(píng)分采用陽(yáng)性細(xì)胞比例方法：0分<5%；1分6%～35%；2分36%～70%；3分> 70%。為了進(jìn)一步明確CENPU蛋白表達(dá)水平與HCC患者的臨床病理特征之間的相關(guān)性，根據(jù)CENPU蛋白的表達(dá)量進(jìn)行分組，高表達(dá)(2分或者3分)，低表達(dá)(0分或則1分)，見(jiàn)圖1。

圖1 肝癌組織中CENPU的代表性免疫染色圖片

2 結(jié)果

2.1 CENPU mRNA在肝癌組織中表達(dá)情況 CENPU mRNA在HCC患者肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常肝組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)，見(jiàn)圖2A；且在HCC患者，按不同病理分期分為4組，病理分級(jí)采用Edmondson-Stein方法，CENPU的mRNA在肝癌組織中的表達(dá)量隨著病例分級(jí)逐次遞增，見(jiàn)圖2B。

圖2 在UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析CENPU mRNA表達(dá)情況

2.2 HCC組織中CENPU蛋白與臨床病理特征的關(guān)系 CENPU的蛋白表達(dá)量與腫瘤患者年齡、性別、病理分級(jí)、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、肝硬化結(jié)節(jié)的數(shù)目、腫瘤包膜是否完整、腫瘤的分期及分級(jí)、是否具有HBsAb、是否感染HBV及HCV、生化指標(biāo)均無(wú)關(guān)系(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 CENPU不同表達(dá)量與臨床病理指標(biāo)相關(guān)性分析

2.3 CENPU蛋白在HCC患者中表達(dá)與患者生存期的關(guān)系 首先通過(guò)GEPIA在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)分析顯示，生存曲線(xiàn)結(jié)果顯示低表達(dá)組總生存期(OS)以及無(wú)瘤生存期(DFS)顯著高于高表達(dá)組(P<0.05)，見(jiàn)圖3。根據(jù)TCGA的數(shù)據(jù)結(jié)果初步可知CENPU在HCC患者的高低表達(dá)可作為HCC患者的與肝癌患者的預(yù)后具有一定的相關(guān)性。前述免疫組化染色強(qiáng)度評(píng)分方法，有7.6%(6/79)的HCC組織顯示陰性(0分)，38%(30/79)的HCC組織顯示弱陽(yáng)性(1分)，40.5%(32/79)的HCC組織中顯示中度染色(2分)，13.9%(11/79)的HCC組織呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性(3分)。在79例病理組織中低表達(dá)人數(shù)有36例(45.6%)，高表達(dá)有43例(54.4%)，比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.072)。CENPU蛋白在肝癌中高表達(dá)組患者的總生存期低于低表達(dá)組患者的生存期(P=0.023)，見(jiàn)圖4。但CENPU蛋白的高低表達(dá)與HCC患者的無(wú)瘤進(jìn)展期無(wú)相關(guān)性(P=0.184)。

圖3 肝癌患者中CENPU的mRNA上調(diào)與預(yù)后不良有關(guān)

圖4 基于CENPU蛋白表達(dá)水平的HCC患者生存曲線(xiàn)

2.4 肝癌總生存率預(yù)后指標(biāo)的單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析 進(jìn)一步采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸進(jìn)行單因素分析發(fā)現(xiàn)，CENPU表達(dá)水平、病理分期、GGT是HCC患者總生存期的危險(xiǎn)因素。多因素分析顯示，CENPU表達(dá)水平、病理分期、GGT顯示是影響HCC患者總生存期的因素，見(jiàn)表2。

表2 肝癌總生存率預(yù)后指標(biāo)的單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

3 討論

肝癌為發(fā)病率和死亡率都極高的惡性腫瘤，近年來(lái)從發(fā)病危險(xiǎn)因素分析到早期診斷、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物的尋找，再到放化療耐藥機(jī)制的探討，以及靶向藥物的研發(fā)成為了研究的熱點(diǎn)，并且取得了一定的進(jìn)展[17-19]。HCC的發(fā)生、發(fā)展主要由復(fù)雜的遺傳因素(遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素、基因變異等)和環(huán)境因素協(xié)同作用，共同促進(jìn)肝炎-肝硬化-肝癌的轉(zhuǎn)變效應(yīng)[20]。因此找到預(yù)測(cè)患者預(yù)后的指標(biāo)，亦或者尋找潛在的治療靶點(diǎn)，是有效提高肝癌患者生存期的途徑。

課題組前期通過(guò)加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(Weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)方法研究肝細(xì)胞癌(HCC)中肝癌干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性[21]。我們通過(guò)進(jìn)一步的篩選發(fā)現(xiàn)CENPU與肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。CENPU是一種著絲粒結(jié)合蛋白，在整個(gè)細(xì)胞周期中都被定位在著絲粒中,被確認(rèn)為著絲粒的組成成分，在細(xì)胞周期進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。CENPU基因在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，其在多種癌癥中過(guò)表達(dá)與腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)，但在肝癌中尚無(wú)關(guān)于其與患者預(yù)后影響的相關(guān)研究，遂本實(shí)驗(yàn)展開(kāi)了相關(guān)研究，以期了解CENPU是否是影響HCC患者預(yù)后的因素，是否可以作為監(jiān)測(cè)HCC患者不良預(yù)后的指標(biāo)。

本研究首先通過(guò)UALCAN在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)其mRNA水平高表達(dá)與HCC患者不良預(yù)后相關(guān)，提示其可能作為一種促癌基因參與到肝癌的進(jìn)展中，導(dǎo)致疾病的進(jìn)展，從而降低患者生存期。這與膀胱癌、腔內(nèi)乳腺癌組織中的結(jié)果相一致[11,22]，CENPU較鄰近的正常組織表達(dá)顯著上調(diào)，并且CENPU高表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān)[12,23]。Wan等[24]通過(guò)基于生物信息學(xué)的分析鑒定CENPU是與肝細(xì)胞癌相關(guān)的新基因，其可能為監(jiān)測(cè)肝細(xì)胞癌的一種潛在標(biāo)志物，而在此前是否參與致癌作用，需要進(jìn)一步的分子生物學(xué)來(lái)探討其參與肝癌的分子機(jī)制。Wang等[25]在探索具有可能用作血清/血漿生物標(biāo)志物的新型circRNA及其在肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)病機(jī)理中發(fā)現(xiàn)CENPU是肝癌不良預(yù)后的指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用免疫組織化學(xué)染色法驗(yàn)證CENPU在蛋白水平上表達(dá)情況。通過(guò)比較CENPU表達(dá)量與肝癌患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)其與患者的年齡、性別、病理分級(jí)、腫瘤大小及數(shù)目、AFP的表達(dá)量、腫瘤包膜是否完整、是否感染HBV及HCV以及生化指標(biāo)等臨床基本特征均不相關(guān)。由于本研究標(biāo)本數(shù)量較少，具有一定的偏倚性，所以需要進(jìn)一步多中心、大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。而通過(guò)Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)，HCC組織中高表達(dá)CENPU患者總體生存率均顯著低于低表達(dá)者，表明HCC患者組織中CENPU表達(dá)水平和臨床預(yù)后緊密相關(guān)，有望應(yīng)用到臨床上通過(guò)監(jiān)測(cè)該指標(biāo)，為患者預(yù)后評(píng)估予以一定的指導(dǎo)。Yang等[10]發(fā)現(xiàn)CENPU基因?qū)?xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)程的影響，CENPU的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小有關(guān)。本研究中通過(guò)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸單因素和多因素分析結(jié)果表明，CENPU表達(dá)水平、患者的病理分期、GGT指標(biāo)可作為影響HCC患者總生存期的危險(xiǎn)因素。本研究存在不足之處：其一，本次收集的樣本量較少，需要加大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證；其二，未進(jìn)行與正常患者肝組織標(biāo)本進(jìn)行比較，無(wú)法證實(shí)肝癌患者正常肝組織CENPU的表達(dá)量；其三，未進(jìn)行相關(guān)分子生物水平上的機(jī)制研究，所以需要進(jìn)一步研究CENPU在肝癌中具體機(jī)制以更好地指導(dǎo)其臨床應(yīng)用。

4 結(jié)論

CENPU在HCC中表達(dá)明顯升高，與患者的病理分期、GGT指標(biāo)相關(guān)，且其高表達(dá)者生存期降低，可能是影響肝癌患者不良預(yù)后的一個(gè)因素及治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。