孟珈同，李軍鴿，王永春，邱智東，唐秋竹*

（長春中醫(yī)藥大學創(chuàng)新實踐中心·吉林長春·130117）

荊防敗毒散為明代張時徹所著的《攝生眾妙方》中記載,處方組成為防風、獨活、荊芥、羌活、柴胡、枳殼、前胡、茯苓、桔梗、川芎、甘草共11味藥[1],有發(fā)散風寒,解表祛濕的作用,亦可用于痢疾、瘡腫初起而有表寒癥者[2]。在本次新冠肺炎疫情中,由于荊防敗毒散有預防和早期治療的作用,因此被列入治療新冠肺炎的推薦藥物名單[3]。目前對荊防敗毒散的研究方向大多為臨床應用或獸類、禽類疫病治療,對其本身或其制劑的質(zhì)量控制標準較少。因此本研究將建立古代名方荊防敗毒散物質(zhì)基準的質(zhì)量標準研究,為后續(xù)新劑型開發(fā)打下基礎(chǔ)。

1 儀器、藥材與試劑

1.1 儀器

LC-2030型高效液相色譜儀（日本島津）；Techmate C18色譜柱（4.6 mm×250mm,5μm）；真空冷凍干燥機（Epsilon）；XSE-105DU十萬分之一電子天平（梅特勒）；ZFS型手提式紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；硅膠G板（青島海洋）。

1.2 藥材與試劑

實驗中所用飲片防風、獨活、荊芥、羌活、柴胡、枳殼、前胡、茯苓、桔梗、川芎、甘草均由吉林省北藥藥材加工有限公司提供,以上藥材飲片經(jīng)長春中醫(yī)藥大學翁麗麗教授鑒定及檢驗均合格；升麻素苷對照品（純度：94.6%,批號111522-201913）、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品（純度：97.4%,批號111523-201811)、獨活對照藥材（批號120940-201612）、柴胡對照藥材（批號120992-201509）以上均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈和磷酸為色譜純,水為超純水,其余試劑均為分析純。

2 荊防敗毒散物質(zhì)基準制備

荊防敗毒散原文為“治瘡腫初起,羌活、獨活、柴胡、前胡、枳殼、茯苓、防風、荊芥、桔梗、川芎各一錢五分,甘草五分,上用水一鐘半,煎至八分,溫服?！苯?jīng)考證,明代的1錢約合現(xiàn)代的3.73g,五分約合現(xiàn)代的1.87g,明代1鐘約合現(xiàn)代的300ml[4]。即取防風、獨活、荊芥、羌活、柴胡、枳殼、前胡、茯苓、桔梗、川芎各5.60g,甘草1.87g,加水450mL,煎煮約20min,過濾后得煎煮液約240mL,濃縮后冷凍干燥,即得。

3 薄層鑒別

3.1 獨活

3.1.1 供試品溶液制備

取荊防敗毒散物質(zhì)基準2.5g,加乙醚50mL,超聲15min,濾過,蒸干后加1mL乙酸乙酯溶解點樣。

3.1.2 對照藥材溶液制備

取獨活對照藥材1g,按“3.1.1”方法制備。

3.1.3 陰性對照溶液制備

取荊防敗毒散獨活陰性凍干粉2.5g,按“3.1.1”方法制備。

取供試品溶液10μL、陰性對照溶液10μL,對照藥材溶液2μL,以石油醚（30～60℃）-乙醚（3：2）為展開劑展開,在365nm紫外光燈下觀察[5]。結(jié)果顯示,供試品在與對照藥材色譜相同位置上顯相同顏色的熒光斑點,且陰性對照無干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 獨活薄層鑒別

3.2 柴胡

3.2.1 供試品溶液制備

取荊防敗毒散物質(zhì)基準2.5g,加30mL甲醇超聲20min,過濾,蒸干濾液,加水20mL溶解殘渣,用40mL水飽和的正丁醇提取,用20mL氨試液和10mL氨試液分別洗滌2次,棄去洗液,再用40mL正丁醇飽和的水洗滌,棄去洗液,將正丁醇液蒸干,加2mL甲醇溶解點樣[6]。

3.2.2 對照藥材溶液制備

取柴胡對照藥材lg,加水75mL,煎煮30min,共2次。合并煎煮液,過濾,將濾液蒸干,加5mL甲醇溶解點樣。

3.2.3 陰性對照溶液制備

取荊防敗毒散柴胡陰性凍干粉2.5g,按“3.2.1 ”方法制備。

吸取上述三種溶液各10μL,乙酸乙酯-乙醇-水（10：2：1）為展開劑,展開后晾干,噴2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液,在105℃下加熱至斑點顯色清晰,于365nm紫外光下觀察[7]。結(jié)果顯示,供試品色譜與對照藥材色譜在相同位置顯相同顏色熒光斑點,且陰性對照無干擾。結(jié)果見圖2。

圖2 柴胡薄層鑒別

4 含量測定

4.1 色譜條件

Techmate C18色譜柱（4.6 mm×250mm,5μm）；流動相乙腈（A）-0.05%磷酸水（B）；梯度洗脫（0-30min,12%A；31-35min,12%-15%A；36-70min,15%A）；波長254 nm,柱溫40℃,進樣量10μL；理論板數(shù)按升麻素苷峰計算應不低于2000。

4.2 對照品溶液制備

精密稱定升麻素苷對照品與5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品適量,加甲醇制成每1mL各含60μg的溶液。

4.3 供試品溶液制備

精密稱定荊防敗毒散物質(zhì)基準2.5g,精密加入甲醇50mL,稱定重量,回流2h,放冷,用甲醇補足減失重量,搖勻后過濾,即得。

4.4 陰性對照液制備

精密稱定荊防敗毒散防風陰性凍干粉2.5g,按“4.3”項下方法制備。

4.5 專屬性試驗

按“4.1”項下色譜條件,對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10μL進樣,測定。結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示,供試品色譜與對照品色譜在相同保留時間出現(xiàn)色譜峰,且分離度符合要求,陰性對照無干擾。結(jié)果表明,該方法專屬性良好。

圖3 專屬性高效液相色譜圖

4.6 線性范圍考察

用甲醇分別配制濃度為0.0076、0.0227、0.0379、0.0606、0.0758mg/mL的升麻素苷對照品溶液和濃度為0.0058、0.0115、0.0288、0.0462、0.0577mg/mL的5-O-甲基維斯阿米醇苷溶液。按照“4.1”項下色譜條件進行測定,以進樣量為橫坐標（X）,峰面積（Y）為縱坐標考察線性關(guān)系。升麻素苷回歸方程為：Y=1754978 x+2336 r=0.9999,表明升麻素苷0.076～0.758μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。5-O-甲基維斯阿米醇苷回歸方程為：Y=1891149 x+5339 r=0.9999,表明5-O-甲基維斯阿米醇苷在0.058～0.577μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

4.7 精密度

取“4.3”項下供試品溶液,按“4.1”色譜條件連續(xù)進樣6次,每次10μL,記錄色譜峰面積。升麻素苷RSD為0.39%,5-O-甲基維斯阿米醇苷RSD為0.45%。結(jié)果表明,儀器精密度良好。

4.8 重復性試驗

取同一荊防敗毒散物質(zhì)基準6份,按“4.3”項下方法制備,以“4.1”項下色譜條件測定。升麻素苷平均含量為0.7175 mg/g,RSD為0.82%,5-O-甲基維斯阿米醇苷平均含量為0.6294 mg/g,RSD為0.92%,結(jié)果表明,本方法重復性良好。

4.9 穩(wěn)定性試驗

取“4.3”項下供試品溶液,分別于0、4、8、12、16、24 h進樣10μL,測定峰面積。升麻素苷RSD為0.34%,5-O-甲基維斯阿米醇苷RSD為0.67%,結(jié)果表明,供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

4.10 準確度

精密稱定已知升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷濃度的物質(zhì)基準6份,每份1.0g,分別加入濃度為0.0142 mg/mL的升麻素苷對照品和濃度為0.0199 mg/mL的5-O-甲基維斯阿米醇苷的混合對照品溶液50mL,按“4.3”項下方法制備,測定峰面積。計算得升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷總回收率為96.57%,RSD為1.95%,結(jié)果表明,該方法準確度良好。結(jié)果見表1。

表1 準確度試驗結(jié)果

4.11 物質(zhì)基準含量測定

取5批荊防敗毒散物質(zhì)基準,按照“4.3”項下方法制備,進樣量10μL。5批物質(zhì)基準平均轉(zhuǎn)移率為22.66%,2020年版《中國藥典》防風藥材升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的總量不得少于0.24%,按20%轉(zhuǎn)移率計算,每1g荊防敗毒散物質(zhì)基準中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的總量不得少于0.47mg。結(jié)果見表2。

表2 防風藥材升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷總含量測定結(jié)果及物質(zhì)基準轉(zhuǎn)移率

5 結(jié)論

經(jīng)多批荊防敗毒散物質(zhì)基準驗證,本研究建立的薄層色譜方法分離效果好,陰性對照無干擾；含量測定方法專屬性強,具有良好的重復性、穩(wěn)定性,準確度良好,含量測定結(jié)果準確可靠。獨活和柴胡的薄層色譜鑒別與升麻素苷和5-0-甲基維斯阿米醇苷總量的含量測定能有效控制荊防敗毒散物質(zhì)基準質(zhì)量,為荊防敗毒散后續(xù)新劑型開發(fā)打下基礎(chǔ)。