陳夢(mèng)婷，楊欣諭，李翱翔，潘萍，陳宏降，陶倩，羅益遠(yuǎn)*

（1.浙江醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，寧波315100；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州310053）

覆盆子,薔薇科懸鉤子屬華東覆盆子（Rubus chingii Hu）的干燥果實(shí),其在我國(guó)已有悠久的藥用歷史,具有益腎固精縮尿,養(yǎng)肝明目的作用,具有研究前景[1]。市場(chǎng)上諸多覆盆子藥材難以達(dá)到藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),除品種原因以外,很大程度上由加工方式造成[2]?！吨袊?guó)藥典》2020版規(guī)定覆盆子的加工方法為：沸水中略燙或略蒸,取出,干燥[3]。因此,需要一種能提高覆盆子有效成分含量的加工方法,從而提高覆盆子的質(zhì)量。

覆盆子化學(xué)成分主要含有黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)、萜類(lèi)、多糖類(lèi)等[4-5]。2020版《中國(guó)藥典》中僅以鞣花酸和山柰酚-3-O-蕓香糖苷的含量評(píng)價(jià)覆盆子藥材質(zhì)量[3],單一的化學(xué)成分對(duì)藥材質(zhì)量的優(yōu)劣反映往往不夠全面,也不符合中醫(yī)藥的“整體觀”。多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)法是將多個(gè)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)歸一化處理,根據(jù)權(quán)重轉(zhuǎn)化成相對(duì)評(píng)價(jià)值,將中藥成分的復(fù)雜性及交互性完整體現(xiàn)[6]。因此,為判斷覆盆子加工工藝對(duì)藥材品質(zhì)的影響,本研究通過(guò)測(cè)定不同加工工藝的覆盆子的總黃酮、多酚、多糖、三萜,采用TOPSIS綜合評(píng)價(jià)[7],以篩選覆盆子的最優(yōu)加工方法,保證覆盆子藥材質(zhì)量,為覆盆子藥材質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與試藥

MULTISKAN Sky酶標(biāo)儀（Thermo Fisher公司）；SB-5200DT超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司,300W、50kHz）；數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋（常州朗越儀器制造有限公司）；TC-15恒溫電熱套（海寧市華星儀器廠）；EX125DZH電子天平（奧豪斯儀器常州有限公司）；Spring-R10純水儀（RO-DI）。

蘆?。ㄅ?hào)：B20771,購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司）；齊墩果酸（批號(hào)：B20954,購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司）；香草醛（批號(hào)：V820371,購(gòu)于麥克林）；沒(méi)食子酸（批號(hào)：B20851,購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司）；甲醇、乙酸、高氯酸、乙酸乙酯、乙醇、碳酸鈉、鉬酸鈉（二水）、鎢酸鈉（二水）、蒽酮、濃硫酸、氯化鋁為分析純。

覆盆子樣品為2020年5月浙江磐安實(shí)地采集,按照如下方法加工：S1沸水中略燙,曬干；S2略蒸后,曬干；S3微波殺青后40℃烘干；S4為樣品發(fā)酵24小時(shí)后,40℃烘干；S5曬干品；S6沸水中略燙-40℃干燥-回潮-發(fā)酵12小時(shí)-40℃二次干燥。S7-S10為沸水中略燙后分別采用40、50、60、70℃烘干。

2 方法

2.1 總黃酮含量測(cè)定[8-10]

2.1.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品4.0 mg,加入甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中,得到濃度為0.40 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備

精密稱取干燥至恒重的樣品1.0 g,置于100 mL具塞錐形瓶,加20 mL甲醇,搖勻,稱重,超聲波提取60分鐘后取出,冷卻,稱重,補(bǔ)足損失,過(guò)濾、取續(xù)濾液即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mL于具塞試管中,分別加入0.01mol/L的三氯化鋁-甲醇至5mL,混勻后放置10分鐘,置酶標(biāo)儀中,于360 nm波長(zhǎng)處,照UV-AIS法[11],測(cè)得吸光度值,以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、樣品濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo),繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.4 樣品測(cè)定取2.0 mL供試品溶液,加入0.01 mol/L的三氯化鋁-甲醇3.0 mL,混合均勻后放置10分鐘,置酶標(biāo)儀中,在360 nm波長(zhǎng)處,照UV-AIS法[11],測(cè)得吸光度值,根據(jù)線性關(guān)系,計(jì)算樣品中的總黃酮含量。

2.2 總多酚含量測(cè)定

參考《中國(guó)藥典》2020年版（四部）通則2202中“鞣質(zhì)含量測(cè)定方法”[12]。

2.2.1 對(duì)照品溶液制備精密稱定適量干燥至恒重的沒(méi)食子酸對(duì)照品,加入甲醇,制成0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密吸取對(duì)照品溶液0.05、0.2、0.25、0.3、0.4 mL,置于25 mL具塞錐形瓶中,加水至5 mL,精密加入磷鉬鎢酸試液1 mL,搖勻,靜置6～8分鐘,加入15%碳酸鈉溶液1 mL,搖勻,置于室溫、避光環(huán)境下充分反應(yīng)2小時(shí)后,置酶標(biāo)儀中,于765 nm波長(zhǎng)處,UA-AIS法[11],測(cè)得吸光度值,以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、樣品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo),繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3 供試品溶液制備

精密稱取覆盆子樣品粉末1.0 g,置于具塞錐形瓶中,加入甲醇25 mL,稱定重量,超聲處理30分鐘（300 W、50 kHz）,放冷,再次稱定重量,補(bǔ)足重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4 樣品測(cè)定

精密吸取1.0 mL供試品溶液,置于25 mL容量瓶中,照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法。自“加水至5 mL”起同上述步驟,測(cè)吸光度值,計(jì)算得出供試品溶液中沒(méi)食子酸的含量。

2.3 三萜含量測(cè)定[13-14]

2.3.1 對(duì)照品溶液制備精密稱取適量齊墩果酸對(duì)照品,加入甲醇,制成0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密量取對(duì)照品溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mL,分別置于15 mL具塞試管中,揮干,放冷,精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液0.1 mL和高氯酸0.4 mL,搖勻,在70℃水浴中加熱15分鐘,立即置冰水浴中冷卻5分鐘,取出,精密加入乙酸乙酯2 mL,搖勻,以相應(yīng)試劑為空白,置酶標(biāo)儀中,于546 nm波長(zhǎng)處,照UV-AIS法[11],測(cè)得吸光度值,以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、樣品濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo),繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.3 供試品溶液制備[15]

精密稱取樣品粉末1 g,置具塞錐形瓶中,加乙醇25 mL,超聲45分鐘,濾過(guò),取濾液于100 mL容量瓶中,用適量乙醇分次洗滌濾器、濾渣,將洗液并入容量瓶,加乙醇定容,搖勻,即得。

2.3.4 樣品測(cè)定

精密量取0.1 mL供試品溶液,置具塞試管中,照“2.3.2”項(xiàng),自“揮干”起制備,測(cè)吸光度值,計(jì)算供試品溶液中齊墩果酸的含量。

2.4 多糖含量測(cè)定[14]

2.4.1.對(duì)照品溶液制備

精密稱取的10 mg干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖,加蒸餾水溶解,置于100 mL容量瓶中,定容,得到葡萄糖濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別精密吸取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于10 mL具塞試管,分別加水至2.0 mL,精密加入蒽酮-硫酸溶液6 mL。水浴加熱15分鐘后取出后,于冷水中冷卻15分鐘。以相應(yīng)試劑為空白,于625 nm波長(zhǎng)處,照UV-AIS法[11],測(cè)得吸光度值,以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、樣品濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.3 供試品溶液制備

精密稱取覆盆子樣品粉末1 g,置于具塞錐形瓶中,精密加入25 mL純水,稱定重量,超聲提取45分鐘,冷卻后,稱定重量,補(bǔ)足溶液,濾過(guò),取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.4.4 樣品測(cè)定

精密吸取2 mL供試品溶液置10 mL容量瓶中,置于具塞試管中,照“2.4.2”項(xiàng)下的方法,自“精密加入蒽酮-硫酸溶液”起,測(cè)定吸光度,計(jì)算即得供試品溶液中多糖的含量。

2 .5 TOPSIS分析

采用TOPSIS法,將各個(gè)成分的含量作為綜合評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn),對(duì)不同加工工藝覆盆子藥材的質(zhì)量進(jìn)行分析與評(píng)價(jià),依據(jù)結(jié)果排序,判斷覆盆子的質(zhì)量?jī)?yōu)劣。

3 結(jié)果與分析[7 ,1 6 -2 0 ]

3.1 多指標(biāo)成分的測(cè)定結(jié)果及分析

不同加工工藝覆盆子中各指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同加工工藝覆盆子中各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果（%）Table 1 Determination results of multiple indexes in R.chingii with different processing techniques(%)

3.2 TOPSIS分析[17-18]

3.2.1 原始數(shù)據(jù)歸一化處理

不同加工覆盆子藥材的多指標(biāo)含量數(shù)據(jù)存在量綱不一致的問(wèn)題,因此需要將矩陣按公式進(jìn)行歸一化處理,建立規(guī)范化矩陣見(jiàn)表2。

表2 歸一化處理后矩陣Table 2 Normalized matrix

如公式所示,αij為第i個(gè)評(píng)價(jià)對(duì)象在第j個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)上歸一化處理后的取值,Xij為第i個(gè)評(píng)價(jià)對(duì)象在第j個(gè)指標(biāo)上的取值,X'ij為經(jīng)倒數(shù)轉(zhuǎn)換后的第i個(gè)評(píng)價(jià)對(duì)象在第j個(gè)指標(biāo)上的取值。

3.2.2 Ci值的計(jì)算

按照下列公式,得出各評(píng)價(jià)指標(biāo)與最優(yōu)方案的接近程度（Ci）。將各評(píng)價(jià)指標(biāo)與最優(yōu)方案的接近程度Ci進(jìn)行排序,Ci越大,綜合質(zhì)量越好。覆盆子藥材的TOPSIS分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同加工覆盆子中多元指標(biāo)成分TOPSIS評(píng)價(jià)結(jié)果Table 3 Topsis evaluation results of multiple index components in different processed Rubus chingii Hu

如公式所示,Di+與Di-分別為第i個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)至最優(yōu)方案、最劣方案的距離；αij為某個(gè)評(píng)價(jià)對(duì)象i在第j個(gè)指標(biāo)的取值。

3.2.3 TOPSIS結(jié)果分析

3.3 小結(jié)

查閱文獻(xiàn)可知,覆盆子的黃酮具有抗補(bǔ)體活性、抗氧化活性、抗炎、抗血栓作用[4,20],多酚具有抗腫瘤、降血糖降血脂、抗氧化活性作用,多糖具有明顯的抗氧化作用以及清除自由基作用[21],三萜類(lèi)具有抗炎作用等[5]。

不同加工工藝的覆盆子藥材中總黃酮、多酚、多糖、三萜測(cè)定結(jié)果如下：總黃酮的含量在0.025%～0.06%,樣品S6的黃酮含量較高,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0602%,其次是S10含量為0.0546%。多酚的含量在0.70%～0.97%,三萜的含量在0.08%～0.19%,其中S1沸水中略燙-曬干加工的樣品多酚含量和三萜含量均較高,質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.9675%,0.1875%。多糖的含量在0.55%～1.47%,樣品S3多糖含量較高,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.4676%,其次是曬干品1.2973%。表明不同加工工藝的覆盆子藥材中各指標(biāo)性成分的含量差異明顯,但單一的化學(xué)成分難以對(duì)中藥進(jìn)行整體性的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

通過(guò)TOPSIS分析可知：沸水中略燙-40℃干燥-回潮-發(fā)酵12小時(shí)-40℃二次干燥的覆盆子綜合質(zhì)量較好,其次為樣品發(fā)酵24小時(shí)后,40℃烘干。對(duì)比可知,綜合質(zhì)量較好的樣品S4、S6均采用過(guò)一段時(shí)間發(fā)酵的加工手段,可見(jiàn)將微生物運(yùn)用到工藝中可提高藥物的綜合質(zhì)量[22]。而同樣是曬干的加工工藝,單一的曬干法得到的覆盆子質(zhì)量較差,蒸后曬干法沒(méi)有沸水中略燙后曬干法的質(zhì)量?jī)?yōu)。沸水中略燙后曬干與烘干法比較,曬干的樣品質(zhì)量更優(yōu),建議采用沸水中略燙后-曬干或60℃烘干法加工。微波殺青后烘干的方法對(duì)覆盆子質(zhì)量提升幫助較小。可見(jiàn)耗時(shí)短、生產(chǎn)效率高的方法均能對(duì)有效成分產(chǎn)生一定的影響[23]。因此就化學(xué)成分而言,建議選用沸水中略燙-40℃干燥-回潮-發(fā)酵12小時(shí)-40℃二次干燥。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定不同加工的覆盆子藥材中總黃酮、多糖、多酚、三萜含量,并對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行TOPSIS綜合評(píng)價(jià),更能夠反映其整體質(zhì)量。篩選覆盆子的最優(yōu)加工方法,為覆盆子藥材的加工和質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)提供參考。