盧澤原，睢大筼，于曉風(fēng)，付雯雯，徐華麗*

（吉林大學(xué)藥學(xué)院·吉林長(zhǎng)春·130021）

結(jié)腸癌（Colon cancer,CRC）是最常見的惡性消化道腫瘤之一,也是全球第三大癌癥[1-2]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),結(jié)腸癌是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[3]。全球每年報(bào)告有120萬新增病例和60萬死亡病例[4]。其惡性程度高,發(fā)病率逐年加快,轉(zhuǎn)移性強(qiáng),治愈率較低且預(yù)后極差,死亡率高,并且呈現(xiàn)出越來越年輕化的趨勢(shì)[5]。20(S)-原人參二醇（20(S)-PPD）是從人參（西洋參）的根、莖、葉中提取得到的20(S)-原人參二醇型皂苷（如Rb1、Rb3、Rg3、Rh2）的苷元,本課題組經(jīng)多年研究證實(shí)其具有良好的抗腫瘤作用[6-10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),20(S)-PPD的抗腫瘤作用與其抑制PI3K/Akt通路的激活、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān),但PPD對(duì)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移作用尚不明確[7]。20(S)-PPD是否可抑制結(jié)直腸SW620細(xì)胞遷移、轉(zhuǎn)移,有待進(jìn)一步研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

20(S)-PPD由吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院天然藥物化學(xué)研究室金永日教授提供；SW620細(xì)胞購自上海美軒生物科技有限公司；Matrigel購自BD；E-cadherin,Vimentin抗體購自Cell Signaling Technology；高糖DMEM培養(yǎng)液購自Invitrogen；其他試劑由長(zhǎng)春鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀（Molecular Devices,USA）；熒光倒置顯微鏡TE2000-M（Nikon）；Mini-Protean垂直電泳系統(tǒng)（Bio-Rad）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTT實(shí)驗(yàn)

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,用培養(yǎng)液稀釋,接種于96孔板,每孔200μl。貼壁24 h后加入不同濃度20(S)-PPD作用20 h,每孔加入MTT 20μl,繼續(xù)孵育4 h,570 nm測(cè)OD值,計(jì)算細(xì)胞生存率。

2.2 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,用無血清培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞,接種于Transwell小室。加入20(S)-PPD（10、20、30μM）作用24 h,加入1%結(jié)晶紫,染色,熒光倒置顯微鏡下拍照,ImageJ軟件計(jì)算圖片中染色細(xì)胞數(shù)量。

2.3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

以培養(yǎng)液：Matrigel=5：1的比例將Matrigel膠稀釋,每個(gè)Transwell小室中加入60μl稀釋的Matrigel膠。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,用無血清培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞,接種于Transwell小室。加入20(S)-PPD（10、20、30μM）作用24 h,加入1%結(jié)晶紫,染色,熒光倒置顯微鏡下拍照,ImageJ軟件計(jì)算圖片中染色細(xì)胞數(shù)量。

2.4 Western Blot

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,用培養(yǎng)液稀釋,接種于6孔板。貼壁24 h后加入不同濃度20(S)-PPD作用24 h,通過Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)后以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用軟件SPSS分析數(shù)據(jù),組間比較采用Student`s t-test檢驗(yàn),*P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 PPD對(duì)SW620細(xì)胞活力的影響

結(jié)果如圖1所示,PPD在40、50及100μM劑量時(shí)明顯殺傷SW620細(xì)胞（P＜0.05）,但PPD在10、20、25及30μM劑量時(shí)對(duì)SW620細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)顯著細(xì)胞殺傷作用（P＞0.05）,因此我們選用10、20和30μM用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1.20(S)-PPD對(duì)SW620細(xì)胞生存率的影響與20(S)-PPD 0 M組比較，*P＜0.05。

3.2 20(S)-PPD對(duì)SW620細(xì)胞遷移能力的影響

加入10、20及30μM 20(S)-PPD后,SW620細(xì)胞在Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中顯著降低了穿膜細(xì)胞數(shù)量（P＜0.05）,并且隨20(S)-PPD劑量增加,抑制SW620細(xì)胞穿膜的作用逐漸增強(qiáng),呈現(xiàn)一定劑量依賴性,結(jié)果見圖2。

圖2.20(S)-PPD對(duì)SW620細(xì)胞遷移的影響與20(S)-PPD 0 M組比較，*P＜0.05。

3.3 20(S)-PPD對(duì)SW620細(xì)胞侵襲能力的影響

從圖3可見,加入10、20及30μM 20(S)-PPD后,SW620細(xì)胞在侵襲實(shí)驗(yàn)中均顯著降低了穿膜細(xì)胞數(shù)量（P＜0.05）,并且隨20(S)-PPD劑量增加,抑制SW620細(xì)胞穿膜的作用逐漸增強(qiáng),呈現(xiàn)一定劑量依賴性。

圖3.20(S)-PPD對(duì)SW620細(xì)胞侵襲的影響與20(S)-PPD 0 M組比較，*P＜0.05。

3.4 20(S)-PPD對(duì)SW620細(xì)胞E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)的影響

從圖4可見,加入20(S)-PPD處理后E-cadherin蛋白表達(dá)逐漸增加,vimentin蛋白表達(dá)逐漸下降,呈劑量依賴性。

圖4.20(S)-PPD對(duì)SW620細(xì)胞E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)的影響與20(S)-PPD 0 M組比較，*P＜0.05。

4 討論

由于傳統(tǒng)化療藥物具有較強(qiáng)的毒副作用,而且容易產(chǎn)生耐藥性。近年來,越來越多研究表明天然產(chǎn)物能夠產(chǎn)生良好的抗腫瘤作用[11]。與傳統(tǒng)化療藥物相比,天然產(chǎn)物具有更低的毒副作用,為抗腫瘤藥物的開發(fā)提供了廣闊的資源。天然產(chǎn)物已成為新的抗癌藥物的豐富來源,目前使用的約50%的抗癌藥物直接或間接來源于天然產(chǎn)物[12]。在這些化合物中,包括生物堿、皂苷、多糖、多酚和不飽和脂肪酸。

人參皂苷是人參的主要生物活性成分之一,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞等多種生物活性。研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷可以抑制腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。我們前期實(shí)驗(yàn)表明,20(S)-PPD具有誘導(dǎo)多種腫瘤凋亡的作用,但20(S)-PPD能否抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲尚不清楚。結(jié)果發(fā)現(xiàn)20(S)-PPD在40μM以上時(shí)可以明顯殺傷SW620細(xì)胞,但在40μM以下對(duì)SW620細(xì)胞沒有殺傷作用,因此我們選用10、20和30μM用于后續(xù)的遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)以排除由于藥物殺傷細(xì)胞對(duì)遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的影響。圖2和圖3結(jié)果顯示,20(S)-PPD在10、20和30μM的劑量下能明顯的抑制SW620細(xì)胞的遷移和侵襲能力（P＜0.05）,且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。

腫瘤細(xì)胞持續(xù)侵襲的能力,是腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒缘闹匾獦?biāo)志之一,在該過程中上皮細(xì)胞表型蛋白E-cadherin表達(dá)異常降低,而間質(zhì)細(xì)胞表型蛋白Vimentin表達(dá)異常增加,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移,而抑制Vimentin或增加E-cadherin蛋白表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[13,14]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)20(S)-PPD可以提高E-cadherin蛋白表達(dá),降低Vimentin蛋百表達(dá),從而抑制SW620細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程,有很多蛋白和生物因子參與其中。為了更明確的解釋20(S)-PPD抑制SW620細(xì)胞侵襲的作用,更加深入的研究有待進(jìn)一步開展。