朱偉堃，井改革，趙蕊蕊，王素香，趙丹彤

（1. 菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 菏澤 274000；2. 山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355）

清熱解毒口服液屬清熱解毒類中成藥，收載于《中國藥典》2020年版一部，由石膏、金銀花、玄參、地黃、黃芩、梔子、連翹等十二味中藥組成[1]。具清熱解毒之功效，用于熱毒壅盛所致的發(fā)熱面赤、煩躁口渴、咽喉腫痛；流感、上呼吸道感染見上述證候者。清熱解毒口服液生產(chǎn)廠家眾多，據(jù)統(tǒng)計，目前全國有211家生產(chǎn)企業(yè)。

清熱解毒口服液成分較多，單一指標(biāo)難以對其進(jìn)行質(zhì)量控制，故本文選取了清熱解毒口服液中主要起抑菌[2]、清熱解毒[3-5]作用的4種成分綠原酸、梔子苷、連翹苷、黃芩苷為指標(biāo)進(jìn)行測定和分析。目前，對于4種成分的含量測定雖有報道[6-9]，但均未進(jìn)行系統(tǒng)的信息處理分析，無法綜合系統(tǒng)地評價各生產(chǎn)企業(yè)樣品的質(zhì)量。因此，本文采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時測定清熱解毒口服液4種成分含量的方法，并采用雷達(dá)圖分析，結(jié)合聚類分析和主成分分析對11家企業(yè)的37批次樣品進(jìn)行評價和分類，為清熱解毒口服液的質(zhì)量評價提供了思路和科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 II高效液相色譜儀（安捷倫）；XS105型十萬分之一電子天平（Mettler Toledo）；超純水儀（默克密理博）。

1.2 試藥

綠原酸對照品（批號：110753-202018，含量：96.1 %），梔子苷對照品（批號：110749-201919，含量：97.1 %），連翹苷對照品（批號：110821-201816，含量：95.1 %），黃芩苷對照品（批號：110715-201821，含量95.4 %，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（色譜純，默克公司），磷酸（色譜純，國藥集團(tuán)）；清熱解毒口服液樣品來自2020年山東省內(nèi)市場流通抽樣，具體樣品收集情況見表1。

表1 樣品收集情況

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫：30 ℃。以甲醇（A）-0.1 %磷酸（B）為流動相，梯度洗脫（0～20 min，10 %A→25 %A，90 %B→75 %B；20～40 min，25 %A→50 %A，75 %B→50 %B；40～55 min，50 %A，50 %B；55～60 min，50 %A→10 %A，50 %B→90 %B；60～70 min，10 %A，90 %B）。流速1.0 ml/min，進(jìn)樣量：10 μl。檢測波長326 nm（0～25 min，測定綠原酸），238 nm（25～35 min，測定梔子苷），230 nm（35～45 min，測定連翹苷），276 nm（45～70 min，測定黃芩苷）。

2.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取綠原酸、梔子苷、連翹苷、黃芩苷對照品10.88，10.42，10.38，12.15 mg，分別置25，25，25，50 ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品貯備溶液。分別精密量取上述對照品貯備溶液1.00，1.00，1.00，4.00 ml，置同一10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻即得分別含綠原酸41.82 μg/ml、梔子苷40.47 μg/ml、連翹苷39.49 μg/ml、黃芩苷92.73 μg/ml的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取本品1.00 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.4 專屬性考察

2.4.1 陰性樣品溶液的制備 按工藝方法制備缺少金銀花、梔子、連翹和黃芩的陰性樣品，并按2.3項下方法，制得陰性樣品溶液。

2.4.2 專屬性試驗 分別精密吸取2.2項下的混合對照品溶液，2.4.1項下的缺金銀花、梔子、連翹和黃芩的陰性樣品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。陰性樣品圖譜中，未呈現(xiàn)與綠原酸、梔子苷、連翹苷和黃芩苷保留時間相同的色譜峰，表明制劑中處方的其他藥味及輔料對檢測結(jié)果無干擾，該方法專屬性良好。

圖1 專屬性色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取2.2項下混合對照品溶液3，5，10，12，15 μl，依次注入高效液相色譜儀，按2.1項色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。分別以綠原酸、梔子苷、連翹苷、黃芩苷的進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，各峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，4種成分在一定范圍內(nèi)均有較好的線性關(guān)系。

表2 各成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢測限、定量限

2.6 檢測限和定量限

將2.2項下的混合對照品溶液逐級稀釋，以信噪比（S/N）為10時的相應(yīng)濃度為定量限，各成分定量限見表2；以信噪比（S/N）為3時的相應(yīng)濃度為檢測限，各成分檢測限見表2。

2.7 精密度試驗

分別精密吸取2.2項下混合對照品溶液10 μl，按2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果綠原酸、梔子苷、連翹苷、黃芩苷峰面積的RSD分別為0.23 %，0.27 %，0.53 %，0.59 %，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液10 μl，室溫下放置，按2.1項下色譜條件，分別在0，2，8，12，24 h進(jìn)樣測定，測得供試品溶液中綠原酸、梔子苷、連翹苷、黃芩苷4個成分峰面積的RSD分別為0.34 %，0.26 %，1.33 %，0.13 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗

取同一批清熱解毒口服液樣品（批號：20200306），平行量取6份，每份分別精密量取1.00 ml，按2.3項下方法制得供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，并計算待測成分的含量。結(jié)果綠原酸、梔子苷、連翹苷、黃芩苷的含量平均值分別為0.559，1.595，0.204，2.436 mg/ml，RSD依次為0.29 %，0.31 %，1.85 %，0.22 %，表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收試驗

取2.8項下已知待測成分含量的清熱解毒口服液（批號：20200306）0.50 ml，共6份，分別置25 ml量瓶中，分別依次精密加入2.2項下綠原酸、梔子苷、連翹苷和黃芩苷對照品貯備溶液0.50，2.00，0.30，5.00 ml。按2.3項下方法操作，制備加樣回收樣品溶液。按2.1項下色譜條件進(jìn)行測定，計算回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗結(jié)果

2.11 樣品測定

精密量取各生產(chǎn)企業(yè)的清熱解毒口服液1.00 ml，按2.3項下方法制得供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，依照2.6項下回歸方程計算各成分的含量，含量分布直方圖見圖2。由圖2可見，各成分含量跨度較大，且4種成分的含量分布趨勢均有所不同。同時，按《中國藥典》2020年版一部含量測定項下黃芩苷的含量測定方法，測定了37批次樣品中黃芩苷的含量。并將新建立的方法和藥典方法測得的黃芩苷含量，用SPSS Statistics 19.0進(jìn)行了統(tǒng)計分析，結(jié)果P=0.379＞0.05，說明兩種方法的測定結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步說明建立的方法準(zhǔn)確、可行。

圖2 樣品含量頻率分布直方圖

2.12 多元統(tǒng)計分析

為進(jìn)一步綜合系統(tǒng)分析清熱解毒口服液的質(zhì)量，本研究分別采用雷達(dá)圖分析、聚類圖分析和主成分分析對11家企業(yè)共37批次樣品進(jìn)行分析。

2.12.1 雷達(dá)圖分析 以綠原酸、梔子苷、連翹苷、黃芩苷含量為質(zhì)量評價因子，采用Excel 2003版軟件繪制37批次清熱解毒口服液樣品的雷達(dá)圖，通過比較其輪廓大小及各成分分布情況來反映不同企業(yè)樣品的質(zhì)量差異[10]，結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，B、H、J、N、P企業(yè)樣品中4種成分的輪廓較大且分布平衡度較好，提示其樣品質(zhì)量較好；E、G、I、K、O企業(yè)樣品中4種成分分布平衡度較差；A企業(yè)樣品中4種成分的輪廓較小，提示樣品質(zhì)量有所欠缺。

圖3 雷達(dá)分析圖

2.12.2 聚類分析 以綠原酸、梔子苷、連翹苷、黃芩苷4種成分的含量為變量，采用SPSS Statistics 19.0軟件，選用組間連接法，以Euclidean距離平方為測度，對37批清熱解毒口服液樣品進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果見圖4。企業(yè)聚類結(jié)果顯示，樣品聚為兩大類，J、H、B、P、N企業(yè)為一類，I、G、E、O、K、A企業(yè)為一類。觀察各批次樣品4種成分含量可發(fā)現(xiàn)，J、H、B、P、N企業(yè)樣品4種成分含量普遍較高，說明整體質(zhì)量相對較好。

圖4 聚類分析樹狀圖

以上述提取的1個主成分因子變量繪制得分圖，見圖5。11家企業(yè)的37批次樣品可歸為兩組，其中I、G、E、O、K、A企業(yè)為一組，J、H、B、P、N為一組，其中后一組得分較高，提示其整體質(zhì)量相對較好。主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果、雷達(dá)圖分析結(jié)果相互印證，進(jìn)一步說明聚類的分類結(jié)果和雷達(dá)圖分析結(jié)果可靠。

圖5 樣品主成分得分散點(diǎn)圖

3 討論

3.1 試驗條件的選擇

3.1.1 測定指標(biāo)的選擇 考慮到清熱解毒口服液組成處方較多、成分復(fù)雜，多指標(biāo)測定更利于控制其質(zhì)量，選定綠原酸、木犀草苷、木犀草素、梔子苷、連翹苷、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素作為質(zhì)控指標(biāo)，但在實際測定時發(fā)現(xiàn)，該方法對于木犀草苷和木犀草素的專屬性不強(qiáng)，且陰性模擬樣品中有保留時間相同的色譜雜峰干擾，黃芩素和漢黃芩素含量過低，結(jié)果不易判定。故最后選定了該測定方法下專屬性較強(qiáng)且制劑中含量較高的綠原酸、梔子苷、連翹苷和黃芩苷作為定量控制的指標(biāo)。

3.1.2 波長的選擇 上述選定的4種成分紫外吸收不同，在同一波長下難以獲得理想的靈敏度，故采用DAD采集了4種待測成分在200～400 nm波長范圍內(nèi)的紫外吸收圖譜，結(jié)合液相色譜圖，將波長設(shè)定為0～25 min 時326 nm（測定綠原酸）、25～35 min 時238 nm（測定梔子苷）、35～45 min 時230 nm（測定連翹苷）、45～70 min 時276 nm（測定黃芩苷）。

3.1.3 流動相的考察 曾考察了乙腈-水、甲醇-水等不同流動相系統(tǒng)，等度洗脫，結(jié)果樣品目標(biāo)峰不易分離，導(dǎo)致儀器重復(fù)性較差。查閱文獻(xiàn)[11]發(fā)現(xiàn)水相中加入一定比例的酸可提高待測成分與鄰近雜峰的分離度，且可改善峰形，經(jīng)過進(jìn)一步考察，確定采用甲醇-0.1 %磷酸溶液作為流動相系統(tǒng)，梯度洗脫，可獲得理想的色譜圖。

3.2 質(zhì)量評價模式

本研究采用HPLC建立了清熱解毒口服液中4種主要成分的含量測定方法，并基于多元統(tǒng)計對不同企業(yè)樣品進(jìn)行了綜合分析和分類，發(fā)現(xiàn)不同企業(yè)樣品質(zhì)量差異較大。結(jié)果顯示，雷達(dá)圖分析結(jié)果、聚類分析結(jié)果與主成分分析結(jié)果一致，I、G、E、O、K、A企業(yè)為一類，其樣品質(zhì)量有所欠缺；J、H、B、P、N企業(yè)為一類，其樣品整體質(zhì)量相對較好。

4 結(jié)論

本研究基于HPLC和多元統(tǒng)計建立了不同企業(yè)清熱解毒口服液的質(zhì)量評價模式，可高效、準(zhǔn)確地對測定不同生產(chǎn)企業(yè)的樣品并對其質(zhì)量進(jìn)行評估分類。主成分分析發(fā)現(xiàn)，綠原酸、梔子苷、連翹苷和黃芩苷含量的高低對清熱解毒口服液質(zhì)量影響均較大，提示對于清熱解毒口服液的質(zhì)量評價不可僅局限于單一指標(biāo)，應(yīng)采用多指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量的綜合評估。綜上，本研究建立的清熱解毒口服液HPLC含量測定，基于雷達(dá)圖分析法、聚類分析法和主成分分析法，可對不同企業(yè)清熱解毒口服液的質(zhì)量進(jìn)行全面系統(tǒng)的評價和分類。