李超 李敬風(fēng) 雷尚斌 顧堅(jiān) 陳霞 唐宋琪

(1.湖北省十堰市太和醫(yī)院兒童醫(yī)療中心3病區(qū)，湖北 十堰 442000；2.海南醫(yī)學(xué)院，海南 海口 571100)

過敏性哮喘是一種臨床常見的慢性炎癥性疾病，近年來，哮喘在兒童中的發(fā)病率逐年增加，對(duì)兒童的生活和學(xué)習(xí)帶來嚴(yán)重影響[1-2]。目前，臨床治療兒童過敏性哮喘多采用傳統(tǒng)西醫(yī)療法，雖然可以在一定程度上緩解患兒的病情和癥狀，但同時(shí)伴隨著較多不良反應(yīng)，復(fù)發(fā)率較高[3]。魚藤素是一種天然異黃酮化合物，可從三葉魚藤等豆科藤本植物中提取分離，能夠抑制癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，具有較強(qiáng)的細(xì)胞選擇性和高效低毒的特點(diǎn)[4-5]。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路與哮喘的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，抑制NF-κB/MAPK信號(hào)通路可改善哮喘小鼠的過敏性氣道炎癥反應(yīng)[6]。研究證明，魚藤素可通過下調(diào)NF-κB信號(hào)通路產(chǎn)生抗炎活性，從而減輕卵清蛋白(ovalbumin，OVA)誘導(dǎo)的小鼠哮喘[7]。雖已有研究證明魚藤素具有確切的抗腫瘤作用和一定的抗哮喘作用，但其在兒童過敏性哮喘中的作用研究尚少，其作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究通過OVA致敏和激發(fā)在幼鼠中建立過敏性哮喘模型，觀察魚藤素對(duì)幼鼠過敏性哮喘的抑制作用，并初步探究其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠50只，雌雄各半，4周齡，體質(zhì)量(14.5±0.2)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l件》要求。飼養(yǎng)條件：室溫(22±2)℃，濕度(50±10)%，每天定時(shí)換氣，保持12 h：12 h光暗照明，食水不限。本研究方案獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器 魚藤素(純度>95%，Sigma-Aldrich，批號(hào)：R8875)，甲強(qiáng)龍(輝瑞公司，批號(hào)：AT8319)，IgE、IL-1β、IL-13 ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號(hào)：E-EL-M3034，E-EL-M0037c，E-EL-M0727c)，p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK兔源單克隆抗體，羊抗兔二抗(美國CST公司，批號(hào)：8242，4812，8690，4370，4668，14708)，RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit(美國Thermo Scientific，批號(hào)：K1622)，蛋白定量試劑盒(博士德生物，批號(hào)：AR0146)，OVA、瑞氏-姬姆薩復(fù)合染液、HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：A8041，G1020，G1121)，壓縮空氣式霧化器(石家莊大橋醫(yī)療器械有限公司)，MET VX200-T型渦旋振蕩器[施銳(上海)貿(mào)易有限公司]，DW-86L626超低溫冰箱(海爾集團(tuán))，DYCZ-24KS型雙板垂直電泳儀(北京六一儀器廠)，IX53顯微鏡(日本奧林巴斯)，G:BOX多功能凝膠成像系統(tǒng)(Syngene)，Multiskan MK3酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific)，TGL16MB高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 分組與造模 將50只BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、甲強(qiáng)龍組、魚藤素高劑量組、魚藤素低劑量組，每組各10只。除正常組外，其余各組小鼠均建立過敏性哮喘模型。造模方法：分別在第1天和第14天對(duì)小鼠腹腔注射0.2 mL OVA致敏液(1 mg氫氧化鋁和0.4 mg OVA溶于PBS緩沖液中)進(jìn)行致敏，在第21～23天時(shí)將小鼠置于霧化器內(nèi)，進(jìn)行1% OVA溶液霧化吸入激發(fā)，每次30 min，每天1次，連續(xù)3 d。若小鼠出現(xiàn)呼吸頻率升高、口唇發(fā)紺、點(diǎn)頭呼吸和站立不穩(wěn)等現(xiàn)象則表明造模成功，正常組采用PBS代替OVA致敏液進(jìn)行致敏和霧化激發(fā)[8]。造模期間觀察顯示，模型組、甲強(qiáng)龍組、魚藤素高劑量組、魚藤素低劑量組小鼠均成功建立過敏性哮喘模型。

1.3.2 給藥方法 造模第21天開始給藥。霧化前1 h，魚藤素高劑量組、魚藤素低劑量組小鼠腹腔分別注射4 mg/kg、2 mg/kg 魚藤素溶液(用DMSO溶解后采用生理鹽水稀釋至DMSO濃度小于0.1%)，甲強(qiáng)龍組小鼠腹腔注射1 mg/kg甲強(qiáng)龍溶液，正常組和模型組小鼠腹腔注射等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)3 d(造模第21～23天)。

1.3.3 血漿和支氣管肺泡灌洗液(BALF)收集 末次OVA霧化激發(fā)24 h后，各組小鼠摘眼球取血，與枸櫞酸鈉溶液混合均勻(血液與枸櫞酸鈉溶液的比例為9∶1)，4℃環(huán)境下3 000 r/min離心10 min，離心半徑為12.5 cm，收集上層血漿，分裝在EP管中，置于-80℃冰箱中保存。取血完成后，打開小鼠頸部，分離氣管，在氣管上做一T形切口，插入靜脈留置針，用PBS緩沖液沖洗3次，收集BALF，2500 r/min離心10 min，離心半徑為12.5 cm，分別保存上清和沉淀備用。

1.3.4 ELISA試劑盒檢測(cè)血漿總IgE和BALF中IL-1β、IL-13水平 取各組待測(cè)血漿和BALF上清加入到反應(yīng)孔中，每孔100 μL，每組分別設(shè)4個(gè)復(fù)孔， 37℃孵育90 min，棄掉孔內(nèi)液體，加入100 μL生物素化抗體工作液，37℃孵育60 min，棄掉孔內(nèi)液體，洗滌3次，隨后加入100 μL酶結(jié)合物工作液，37℃孵育30 min后棄掉孔內(nèi)液體，洗滌5次，每孔加入90 μL底物溶液，37℃孵育15 min，加50 μL終止液，450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組大鼠血漿中總IgE和BALF中IL-1β、IL-13的含量。

1.3.5 BALF中炎性細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 離心后的BALF沉淀用0.5 mL PBS緩沖液重懸，移液器吸取10 μL進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后取50 μL細(xì)胞懸液涂片，自然干燥后滴加瑞氏-姬姆薩復(fù)合染液2～3滴使之覆蓋到整個(gè)細(xì)胞涂片，染色1～2 min，然后滴加等量PBS緩沖液，輕輕晃動(dòng)涂片，使之與瑞氏-吉姆薩染液混合均勻后再染色3～5 min，染色完畢后水洗，置于高倍鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。

1.3.6 HE染色觀察小鼠肺組織病理變化 取各組小鼠肺組織，置于4%多聚甲醛中固定48 h，蒸餾水清洗，然后置于不同濃度的酒精中進(jìn)行梯度脫水，制作組織蠟塊，冰上預(yù)冷切片，切片厚度為4 μm，二甲苯脫蠟30 min，在不同濃度梯度的乙醇溶液中復(fù)水，使用蘇木精和伊紅染液分別染細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，脫水、透明后用中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織病理變化。

1.3.7 qRT-PCR檢測(cè)小鼠肺組織IL-1β和IL-13 mRNA水平 稱取0.1 g小鼠肺組織，冰上研磨，加1 mL Trizol裂解液提取組織總RNA，使用RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，作為熒光定量模版。引物由日本Takara 公司設(shè)計(jì)合成，所有樣品均以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)體系：dNTPs 0.5 μL+5×Buffer 5 μL+Taq 酶0.3 μL+MgCl21.5 μL+cDNA 模板2 μL +上下游引物分別1 μL，加去離子水至總體積25 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 5 min，95℃變性 30 s、62℃退火 30 s、72℃延伸 30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃再延伸 5 min終止反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-△△CT的方法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.3.8 Western blot檢測(cè)肺組織p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表達(dá)水平 稱取各組小鼠肺組織0.1 g，剪碎后置于研磨器中冰上研磨，離心后取沉淀，沉淀中加入RIPA裂解液處理組織勻漿，提取組織蛋白，BCA法蛋白定量，確定蛋白濃度，隨后配置15%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，上樣后80 V電泳2 h，60 V轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，將條帶放入10 mL p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK兔源一抗稀釋液中(抗體稀釋比例均為1∶1 000)，條帶在一抗稀釋液中4℃過夜，第2天用TBST緩沖液清洗3次，每次10 min，然后加入羊抗兔二抗(1∶1 000)，37℃孵育2 h，TBST緩沖液清洗3次后滴加ECL發(fā)光液，反應(yīng)1 min后置于凝膠成像系統(tǒng)顯影。免疫印跡實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參蛋白為GAPDH，用Image J軟件分析各個(gè)蛋白對(duì)應(yīng)的灰度值，計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血漿總IgE和BALF中IL-1β、IL-13水平比較 與正常組比較，模型組、甲強(qiáng)龍組、魚藤素高劑量組、魚藤素低劑量組小鼠血漿IgE和BALF中IL-1β、IL-13水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，甲強(qiáng)龍組、魚藤素高劑量組、魚藤素低劑量組小鼠血漿IgE和BALF中IL-1β、IL-13水平均降低(P<0.05)；與甲強(qiáng)龍組比較，魚藤素高劑量組、魚藤素低劑量組小鼠血漿IgE和BALF中IL-1β、IL-13水平升高(P<0.05)，其中，魚藤素高劑量組小鼠血漿IgE和BALF中IL-1β、IL-13水平低于魚藤素低劑量組(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠血漿總IgE和BALF中IL-1β、IL-13水平比較

2.2 各組小鼠BALF中炎性細(xì)胞數(shù)量比較 模型組、甲強(qiáng)龍組、魚藤素高劑量組、魚藤素低劑量組小鼠BALF中炎性細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量均高于正常組(P<0.05)；與模型組比較，甲強(qiáng)龍組、魚藤素高劑量組和低劑量組BALF炎性細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量均減少(P<0.05)；魚藤素高劑量組BALF炎性細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量與甲強(qiáng)龍組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，魚藤素低劑量組BALF炎性細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量高于甲強(qiáng)龍組(P<0.05)；魚藤素高劑量組BALF炎性細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量低于魚藤素低劑量組(P<0.05)，見表3。

表3 各組小鼠BALF中炎性細(xì)胞數(shù)量比較

2.3 各組小鼠肺組織病理變化比較 HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肺組織中氣道血管周圍有少量炎性細(xì)胞存在；與正常組比較，模型組小鼠氣道血管周圍有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡輪廓不清晰，肺泡壁增厚；與模型組比較，甲強(qiáng)龍組、魚藤素高劑量組、魚藤素低劑量組小鼠氣道血管周圍的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象明顯減輕，其中甲強(qiáng)龍組的炎癥滲出減少最顯著，魚藤素高劑量組和低劑量組次之，與正常組比較，肺組織仍存在肺泡壁水腫、增厚和肺泡輪廓欠清晰現(xiàn)象，見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化(400×)

2.4 各組小鼠肺組織IL-1β和IL-13 mRNA表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組、甲強(qiáng)龍組、魚藤素高劑量組和低劑量組小鼠肺組織IL-1β和IL-13 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，甲強(qiáng)龍組、魚藤素高劑量組和低劑量組小鼠肺組織IL-1β和IL-13 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)；與甲強(qiáng)龍組比較，魚藤素高劑量組和低劑量組小鼠肺組織IL-1β和IL-13 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)，其中，魚藤素高劑量組小鼠肺組織IL-1β和IL-13 mRNA表達(dá)水平低于魚藤素低劑量組(P<0.05)，見表4。

表4 各組小鼠肺組織IL-1β和IL-13 mRNA表達(dá)水平比較

2.5 各組小鼠肺組織p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組、甲強(qiáng)龍組、魚藤素高劑量組和低劑量組小鼠肺組織p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，甲強(qiáng)龍組、魚藤素高劑量組和低劑量組p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05)；與甲強(qiáng)龍組比較，魚藤素高劑量組p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，魚藤素低劑量組p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與魚藤素高劑量組比較，魚藤素低劑量組p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，見圖2、表5。

圖2 Western blot法檢測(cè)肺組織p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表達(dá)

表5 各組小鼠肺組織p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

過敏性哮喘是一種以氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥和可逆的氣道阻塞為主要特征的慢性呼吸系統(tǒng)疾病[9]。流行病學(xué)研究顯示，全球5%～16%的人口患有過敏性哮喘，其中兒童患過敏性哮喘的比例正在逐年上升，嚴(yán)重影響兒童的成長(zhǎng)、學(xué)習(xí)和生活[10]。魚藤素是一種從植物中提取的天然異黃酮化合物，具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，同時(shí)能夠減輕小鼠過敏性哮喘氣道炎癥，但其在兒童過敏性哮喘中的作用尚不清楚[11-12]。本研究采用OVA致敏和激發(fā)在幼鼠中建立過敏性哮喘模型，觀察魚藤素對(duì)幼鼠過敏性哮喘的作用，探究其作用機(jī)制。

IgE是介導(dǎo)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的抗體，其升高與過敏性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[13]。IL-1β和IL-13等炎性因子能夠刺激中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞向氣道聚集，增加氣道黏液分泌和氣道重塑[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，OVA致敏和霧化吸入激發(fā)可使小鼠血漿IgE和BALF中IL-1β、IL-13水平顯著升高。與模型組比較，高劑量和低劑量魚藤素可使小鼠血漿IgE和BALF中IL-1β、IL-13水平降低，其中，魚藤素高劑量組小鼠血漿IgE和BALF中IL-1β、IL-13水平低于魚藤素低劑量組，略高于甲強(qiáng)龍組。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果與上述結(jié)果一致，甲強(qiáng)龍、高劑量和低劑量魚藤素均可使小鼠肺組織IL-1β和IL-13 mRNA表達(dá)水平降低，但與甲強(qiáng)龍組比較，魚藤素高劑量組和低劑量組IL-1β和IL-13 mRNA表達(dá)增加，表明魚藤素能夠減輕哮喘小鼠過敏性和炎性反應(yīng)。

炎癥是過敏性哮喘的典型病理特點(diǎn)，過敏性哮喘的不同階段均有中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在肺組織的浸潤(rùn)和聚集，此類細(xì)胞又可以分泌多種炎癥細(xì)胞因子，對(duì)過敏性哮喘氣道病變有重要作用[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組、甲強(qiáng)龍組、魚藤素高劑量組和低劑量組小鼠BALF炎性細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量均高于正常組。與模型組比較，高劑量和低劑量魚藤素均減少BALF炎性細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量，其中高劑量魚藤素的作用與甲強(qiáng)龍組相當(dāng)。HE染色結(jié)果顯示，模型組小鼠氣道血管周圍有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡輪廓不清晰，肺泡壁異常增厚，而甲強(qiáng)龍和魚藤素可改善OVA所致的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和肺泡壁增厚水腫現(xiàn)象，其中甲強(qiáng)龍組的炎癥滲出減少最顯著，魚藤素高劑量組和低劑量組次之，表明魚藤素可減輕過敏性哮喘小鼠肺組織病理改變，抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

NF-κB和MAPK信號(hào)通路在哮喘發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究表明，NF-κB信號(hào)通路在炎癥和免疫反應(yīng)中均存在大量的基因表達(dá)，當(dāng)被細(xì)胞因子、活性氧等刺激后，可誘導(dǎo)IκB從p50和p65二聚體解離并發(fā)生磷酸化，從而促進(jìn)過敏性哮喘中的炎癥反應(yīng)[18-19]。MAPK信號(hào)通路在多種疾病中普遍表達(dá)，幾乎涉及到哮喘炎癥網(wǎng)絡(luò)的所有方面，是哮喘治療的潛在靶標(biāo)，抑制MAPK信號(hào)通路中的三種主要激酶ERK1/2、JNK和p38 MAPK的活化可顯著改善哮喘炎癥反應(yīng)和氣道重塑[20-22]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，甲強(qiáng)龍、高劑量和低劑量魚藤素可使小鼠肺組織p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表達(dá)降低，其中，魚藤素高劑量組p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表達(dá)水平低于魚藤素低劑量組，與甲強(qiáng)龍組蛋白表達(dá)水平相當(dāng)，表明魚藤素可抑制過敏性哮喘小鼠肺組織NF-κB/MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的活化。

4 結(jié)論

魚藤素能夠減少哮喘小鼠血漿IgE，降低BALF和肺組織炎癥因子IL-1β、IL-13表達(dá)，改善肺組織病變并抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其作用機(jī)制與抑制NF-κB/MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的活化有關(guān)。