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        RAD51和XRCC4在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管鱗癌中的表達(dá)及臨床病理意義*

        2021-12-21 08:21:08張仁靜李雨珊莫琳蹇順海何欣蓉
        西部醫(yī)學(xué) 2021年12期

        張仁靜 李雨珊 莫琳 蹇順海 何欣蓉

        (1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科,四川 南充 637000;2.川北醫(yī)學(xué)院病理教研室,四川 南充 637000;3.南充市中心醫(yī)院檢驗科,四川 南充 637000)

        食管癌是我國四大最常見的腫瘤之一[1],發(fā)病隱匿,80% 以上患者確診時已進(jìn)入中晚期,5 年生存率僅為 10%~30%[2]。我國食管癌患者的組織學(xué)分類以鱗狀細(xì)胞癌為主,占90%左右,發(fā)現(xiàn)能夠預(yù)測食管鱗癌預(yù)后的生物標(biāo)志物和治療的潛在新靶點極為迫切。DNA 雙鏈斷裂(double-strand break,DSB)可以通過兩種主要途徑修復(fù):同源重組(homologousrecombination,HR)和非同源末端連接(nonhomologous end joining,NHEJ)[3-4]。HR需要同源序列作為修復(fù)模板,其途徑的主要蛋白包括由 RAD51、BRCA1、BRCA2 和 PALB2 基因編碼的蛋白[5],RAD51是HR修復(fù)途徑的核心因子,因為其介導(dǎo)同源 DNA 序列和鏈入侵的配對[5-6]。 NHEJ 涉及兩個 DSB 末端的直接連接,幾乎不需要序列同源性,需要四種核心因子Ku、DNA-PKcs、XLF 和 XRCC4-LIG4,XRCC4通過與單個 XLF 二聚體兩個頭部結(jié)構(gòu)域相互作用而結(jié)合 DNA 末端〔7〕,促進(jìn) LIG4 獨立的斷端橋接[7-8]。HR 或 NHEJ 中的缺陷可導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性和腫瘤發(fā)生[9-10]。本實驗擬通過檢測RAD51、XRCC4蛋白在食管鱗癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)情況,探討RAD51、XRCC4蛋白與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系,為食管鱗癌的預(yù)后預(yù)測和治療探索潛在的新臨床靶點。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料 收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2017~2018年食管癌根治術(shù)標(biāo)本62例。術(shù)前均未行放、化療,術(shù)后活檢證實為食管鱗狀細(xì)胞癌且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,標(biāo)本完整。本組患者發(fā)病年齡 41~82歲,平均年齡 62.8歲。男性 45例,女性 17 例。另從中取14例癌旁組織( 距癌灶≥3 cm)作對照。食管癌細(xì)胞系TE-1及人食管上皮細(xì)胞株HEEp均獲贈于川北醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕病研究所,新生牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司),DMEM(Hyclone),0.25%胰酶(Gibco),即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒(產(chǎn)品編號: KIT-5010/5020/5030) 及DAB 顯色試劑盒(產(chǎn)品編號: DAB-2031/2032) (福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司),XRCC4(C-4):sc271087(santa CRUZ);Rad51(ab133543)(abcam)。

        1.2 細(xì)胞復(fù)蘇與傳代 將人食管正常上皮細(xì)胞株HEEp、人食管癌細(xì)胞系TE-1置于37℃水浴箱中快速融化,加入含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液 2 mL,1000 r/min 離心5 min,棄去上清,重懸后將細(xì)胞加入含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞融合至80%~90% 時傳代。

        1.3 免疫細(xì)胞化學(xué) 制作細(xì)胞爬片,分TE-1、HEEP兩組,將細(xì)胞接種于放有爬片的六孔板中,待細(xì)胞鋪滿后,用PBS漂洗,4%多聚甲醛固定,0.5% Txiton X-100打孔,3% H2O2封閉,PBS漂洗,取出并風(fēng)干爬片,分別加入RAD51抗體(1∶300)、XRCC4抗體(1∶300)4℃孵育過夜,PBS漂洗,二抗室溫孵育25 min,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,封片劑封片。

        1.4 石蠟包埋組織免疫化學(xué) 所有標(biāo)本均采用4%中性緩沖甲醛固定、脫水、常規(guī)石蠟包埋、經(jīng)3~5 μm連續(xù)切片,環(huán)保透明劑脫蠟,免疫組化采用MaxVisionTM染色,嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。DAB顯色后,蘇木素復(fù)染,鹽酸酒精分化,脫水,吹干,中性樹膠封片。以PBS 緩沖液代替一抗作陰性對照,已知的陽性組織作為陽性對照。免疫組織化學(xué)結(jié)果判讀:RAD51、XRCC4蛋白均主要定位在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞核,表現(xiàn)為細(xì)胞核呈淺黃色、棕黃色或棕褐色,在細(xì)胞質(zhì)中也有少量表達(dá)。RAD51蛋白根據(jù)著色強度的分值: 無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計為 0、1、2、3分,根據(jù)陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)百分比的分值: 陽性細(xì)胞 <10%、10% ~ 24%、25%~49%、50%~74%、≥75%分別為 0、1、2、3、4分,著色強度分值×陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分值計為免疫組化,本實驗0~1分判為陰性,≥2分為陽性(+)(圖1、2);XRCC4蛋白根據(jù)著色強度的分值: 無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計為 0、1、2、3 分,根據(jù)陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)百分比的分值 <10%、10%~50%、51%~75%、≥75%分別為 1、2、3、4 分,著色強度分值×陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分值計為免疫組化,本實驗0~4分判為陰性,≥5分為陽性(+)(圖3、4)。

        圖1 免疫組織化學(xué)法檢測RAD51蛋白在分化食管鱗癌組織中的表達(dá)

        圖3 免疫組織化學(xué)法檢測XRCC4蛋白在分化食管鱗癌組織中的表達(dá)

        圖4 免疫組織化學(xué)法檢測XRCC4蛋白在分化食管鱗癌配對癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達(dá)

        1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,計數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)(%)表示,采用2檢驗、 Spearman等級相關(guān)檢驗進(jìn)行結(jié)果分析,Kaplan-meier進(jìn)行生存分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果 RAD51、XRCC4蛋白均主要定位癌細(xì)胞核,表現(xiàn)為細(xì)胞核呈淺黃色、棕黃色或棕褐色,在細(xì)胞質(zhì)中也有少量表達(dá)。RAD51、XRCC蛋白在食管癌細(xì)胞TE-1中呈陽性表達(dá),而在正常食管上皮HEEp細(xì)胞中呈陰性表達(dá)(圖5)。

        圖5 免疫組織化學(xué)法檢測RAD51蛋白和XRCC4蛋白的表達(dá)

        2.2 RAD51、XRCC4蛋白在石蠟包埋有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織中呈陽性表達(dá) RAD51在食管鱗癌原發(fā)灶中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織的陽性表達(dá)率,高于配對癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中癌組織陽性表達(dá)率(P=0.000,P=0.065)(表1),XRCC4在食管鱗癌原發(fā)灶灶中的陽性表達(dá)率為62.90%,高于癌旁組織的陽性表達(dá)率,高于配對癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中癌組織的陽性表達(dá)率(P=0.041,P=0.007)(表2)。

        表1 RAD51蛋白在食管鱗癌及癌旁組織中的表達(dá)

        表2 XRCC4蛋白食管鱗癌及癌旁組織中的表達(dá)

        2.3 RAD51、XRCC4蛋白的表達(dá)水平與患者臨床病理指標(biāo)之間均無明顯相關(guān),除了RAD51在女性中的陽性表達(dá)高于男性 RAD51在女性中的陽性表達(dá)高于男性,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.022),在低分化中的陽性表達(dá)率高于在高中分化中的陽性表達(dá)率,患者年齡≥50歲的陽性表達(dá)高于<50歲的陽性表達(dá),腫瘤最大徑≥4 cm的陽性表達(dá)高于最大徑<4 cm的陽性表達(dá),浸潤深達(dá)全層的陽性表達(dá)低于其他組,不同P-TNM分期陽性表達(dá)不同,分期越早陽性表達(dá)率越高,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.079,P=1.000,P=0.409,P=0.743,P=0.649)。XRCC4蛋白在男性中的陽性表達(dá)高于女性,患者年齡≥50歲的陽性表達(dá)高于<50歲的陽性表達(dá),腫瘤最大徑≥4 cm的陽性表達(dá)高于最大徑<4cm的陽性表達(dá),低分化的陽性表達(dá)高于高中分化的陽性表達(dá),浸潤深達(dá)全層的陽性表達(dá)低于其他組,不同P-TNM分期陽性表達(dá)不同,分期越晚陽性表達(dá)率越高,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.318,P=0.533,P=0.235,P=0.459,P=0.733,P=0.868)(表3)。

        表3 RAD51、XRCC4蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其臨床病理特征

        2.4 RAD51、XRCC4蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌中的陽性表達(dá)無相關(guān) 經(jīng)Spearsman等級相關(guān)性分析,RAD51、XRCC4蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌中的陽性表達(dá)無相關(guān)性(r=0.158,P=0.219)。

        2.5 RAD51、XRCC4蛋白陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者的PFS無明顯差異 本研究共隨訪到了53例患者,其中 29人已有復(fù)發(fā),4 人死亡,20人依據(jù)最后一次影像檢查時間定為刪失值。生存分析發(fā)現(xiàn)RAD51蛋白陽性表達(dá)與RAD51蛋白陰性表達(dá)患者的無病進(jìn)展生存期(PFS)無明顯差異(2=0.029,P=0.866),見圖6;而XRCC4蛋白陽性表達(dá)患者相較XRCC4蛋白陰性表達(dá)能有較好的生存獲益,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(2=2.607,P=0.106),見圖7。

        圖6 RAD51蛋白陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者的PFS分析

        圖7 XRCC4蛋白陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者的PFS分析

        3 討論

        食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,而川東北地區(qū)的閬中市、鹽亭縣等又是我國食管癌的高發(fā)區(qū)。很多原因都可以導(dǎo)致食管癌的發(fā)生,其中DNA雙鏈斷裂(DNA double-Strand-break, DSB)發(fā)揮了重要作用。 DSB是細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷,如果不修復(fù),可導(dǎo)致染色體丟失和/或細(xì)胞死亡,如果修復(fù)不當(dāng)會引起基因突變和染色體重排,從而使生物體易患免疫缺陷,神經(jīng)損傷和癌癥[11];修復(fù)DNA 雙鏈斷裂的NHEJ途徑只基于斷裂末端的結(jié)構(gòu)而容易出錯,可以導(dǎo)致DSB 位點短缺、大的缺失或染色體重排,與NHEJ相比HR途徑更精準(zhǔn),但也可以觸發(fā)染色體易位[12]。

        據(jù)報道,RAD51 蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、乳腺癌、上皮性卵巢癌患者中過度表達(dá)[13-16],XRCC4也與食管癌、膀胱癌、星形細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[17-19]。我們實驗結(jié)果顯示RAD51、XRCC4蛋白在食管鱗癌細(xì)胞系TE-1中均呈陽性表達(dá),在食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)水平相較癌旁組織均顯著上調(diào)。本研究臨床病理特征分析顯示,年齡越高、腫瘤直徑越大、分化程度越低,RAD51、XRCC4蛋白陽性表達(dá)率越高的趨勢,但可能由于本實驗樣本量較少,后期將增大樣本量,以驗證RAD51蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系,尤其發(fā)現(xiàn)RAD51蛋白在女性患者中的陽性率高于男性(P<0.05),分析可能與女性患者中組織學(xué)分類以低分化為主有關(guān),進(jìn)一步說明RAD51蛋白表達(dá)水平可能與腫瘤分化程度有關(guān),分化越低,陽性表達(dá)越強??傊覀兊膶嶒灲Y(jié)果表明RAD51、XRCC4蛋白可能參與了食管鱗癌的發(fā)生和進(jìn)展。選擇NHEJ還是HR途徑的關(guān)鍵在于斷裂末端的切除處理[20],NHEJ 修復(fù)的抑制促進(jìn)了基于 HR 的精準(zhǔn)修復(fù)[21-22]。比較RAD51、XRCC4蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌中的陽性表達(dá)率,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),表明兩者可能相互配合,共同參與DSB。Spearman等級相關(guān)檢驗顯示兩者無相關(guān)性,也可能和實驗樣本較少有關(guān)。

        RAD51 過表達(dá)與淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[23-24]。我們的實驗數(shù)據(jù)顯示 RAD51、XRCC4蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)水平高于配對癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中癌組織(均P<0.05),兩者可能起著抑制食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移作用。有研究顯示,與RAD51陽性表達(dá)的患者相比,RAD51陰性表達(dá)患者PFS 顯著延長[25],XRCC4 與星形細(xì)胞瘤預(yù)后不良相關(guān)[26]。生存分析顯示RAD51、XRCC4蛋白陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者的PFS無明顯差異,分析可能與實驗病例數(shù)較少,后期將加大病例量以進(jìn)一步揭示RAD51、XRCC4蛋白表達(dá)在食管鱗癌中的生存意義。以上這些數(shù)據(jù)表明,我們一直認(rèn)為修復(fù)DNA損傷的蛋白可能在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、生存預(yù)后等方面起著重要作用,但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步驗證。

        4 結(jié)論

        RAD51、XRCC4蛋白參與了食管鱗癌的發(fā)病機(jī)制、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并可能和預(yù)后相關(guān),是潛在的食管鱗癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。

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