張仁靜 李雨珊 莫琳 蹇順海 何欣蓉

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院病理教研室，四川 南充 637000；3.南充市中心醫(yī)院檢驗科，四川 南充 637000)

食管癌是我國四大最常見的腫瘤之一[1]，發(fā)病隱匿，80% 以上患者確診時已進(jìn)入中晚期，5 年生存率僅為 10%～30%[2]。我國食管癌患者的組織學(xué)分類以鱗狀細(xì)胞癌為主，占90%左右，發(fā)現(xiàn)能夠預(yù)測食管鱗癌預(yù)后的生物標(biāo)志物和治療的潛在新靶點極為迫切。DNA 雙鏈斷裂(double-strand break，DSB)可以通過兩種主要途徑修復(fù)：同源重組(homologousrecombination，HR)和非同源末端連接(nonhomologous end joining，NHEJ)[3-4]。HR需要同源序列作為修復(fù)模板，其途徑的主要蛋白包括由 RAD51、BRCA1、BRCA2 和 PALB2 基因編碼的蛋白[5]，RAD51是HR修復(fù)途徑的核心因子，因為其介導(dǎo)同源 DNA 序列和鏈入侵的配對[5-6]。 NHEJ 涉及兩個 DSB 末端的直接連接，幾乎不需要序列同源性，需要四種核心因子Ku、DNA-PKcs、XLF 和 XRCC4-LIG4，XRCC4通過與單個 XLF 二聚體兩個頭部結(jié)構(gòu)域相互作用而結(jié)合 DNA 末端〔7〕，促進(jìn) LIG4 獨立的斷端橋接[7-8]。HR 或 NHEJ 中的缺陷可導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性和腫瘤發(fā)生[9-10]。本實驗擬通過檢測RAD51、XRCC4蛋白在食管鱗癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)情況，探討RAD51、XRCC4蛋白與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系，為食管鱗癌的預(yù)后預(yù)測和治療探索潛在的新臨床靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2017～2018年食管癌根治術(shù)標(biāo)本62例。術(shù)前均未行放、化療，術(shù)后活檢證實為食管鱗狀細(xì)胞癌且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，標(biāo)本完整。本組患者發(fā)病年齡 41～82歲，平均年齡 62.8歲。男性 45例，女性 17 例。另從中取14例癌旁組織( 距癌灶≥3 cm)作對照。食管癌細(xì)胞系TE-1及人食管上皮細(xì)胞株HEEp均獲贈于川北醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕病研究所，新生牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)，DMEM(Hyclone)，0.25%胰酶(Gibco)，即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒(產(chǎn)品編號: KIT-5010/5020/5030) 及DAB 顯色試劑盒(產(chǎn)品編號: DAB-2031/2032) (福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，XRCC4(C-4)：sc271087(santa CRUZ)；Rad51(ab133543)(abcam)。

1.2 細(xì)胞復(fù)蘇與傳代 將人食管正常上皮細(xì)胞株HEEp、人食管癌細(xì)胞系TE-1置于37℃水浴箱中快速融化，加入含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液 2 mL，1000 r/min 離心5 min，棄去上清，重懸后將細(xì)胞加入含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%～90% 時傳代。

1.3 免疫細(xì)胞化學(xué) 制作細(xì)胞爬片，分TE-1、HEEP兩組，將細(xì)胞接種于放有爬片的六孔板中，待細(xì)胞鋪滿后，用PBS漂洗，4%多聚甲醛固定，0.5% Txiton X-100打孔，3% H2O2封閉，PBS漂洗，取出并風(fēng)干爬片，分別加入RAD51抗體(1∶300)、XRCC4抗體(1∶300)4℃孵育過夜，PBS漂洗，二抗室溫孵育25 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片劑封片。

1.4 石蠟包埋組織免疫化學(xué) 所有標(biāo)本均采用4%中性緩沖甲醛固定、脫水、常規(guī)石蠟包埋、經(jīng)3～5 μm連續(xù)切片，環(huán)保透明劑脫蠟，免疫組化采用MaxVisionTM染色，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。DAB顯色后，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，脫水，吹干，中性樹膠封片。以PBS 緩沖液代替一抗作陰性對照，已知的陽性組織作為陽性對照。免疫組織化學(xué)結(jié)果判讀：RAD51、XRCC4蛋白均主要定位在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞核，表現(xiàn)為細(xì)胞核呈淺黃色、棕黃色或棕褐色，在細(xì)胞質(zhì)中也有少量表達(dá)。RAD51蛋白根據(jù)著色強度的分值: 無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計為 0、1、2、3分，根據(jù)陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)百分比的分值: 陽性細(xì)胞 <10%、10% ～ 24%、25%～49%、50%～74%、≥75%分別為 0、1、2、3、4分，著色強度分值×陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分值計為免疫組化，本實驗0～1分判為陰性，≥2分為陽性(+)(圖1、2)；XRCC4蛋白根據(jù)著色強度的分值: 無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計為 0、1、2、3 分，根據(jù)陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)百分比的分值 <10%、10%～50%、51%～75%、≥75%分別為 1、2、3、4 分，著色強度分值×陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分值計為免疫組化，本實驗0～4分判為陰性，≥5分為陽性(+)(圖3、4)。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測RAD51蛋白在分化食管鱗癌組織中的表達(dá)

圖3 免疫組織化學(xué)法檢測XRCC4蛋白在分化食管鱗癌組織中的表達(dá)

圖4 免疫組織化學(xué)法檢測XRCC4蛋白在分化食管鱗癌配對癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達(dá)

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)(%)表示，采用2檢驗、 Spearman等級相關(guān)檢驗進(jìn)行結(jié)果分析，Kaplan-meier進(jìn)行生存分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果 RAD51、XRCC4蛋白均主要定位癌細(xì)胞核，表現(xiàn)為細(xì)胞核呈淺黃色、棕黃色或棕褐色，在細(xì)胞質(zhì)中也有少量表達(dá)。RAD51、XRCC蛋白在食管癌細(xì)胞TE-1中呈陽性表達(dá)，而在正常食管上皮HEEp細(xì)胞中呈陰性表達(dá)(圖5)。

圖5 免疫組織化學(xué)法檢測RAD51蛋白和XRCC4蛋白的表達(dá)

2.2 RAD51、XRCC4蛋白在石蠟包埋有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織中呈陽性表達(dá) RAD51在食管鱗癌原發(fā)灶中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織的陽性表達(dá)率，高于配對癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中癌組織陽性表達(dá)率(P=0.000，P=0.065)(表1)，XRCC4在食管鱗癌原發(fā)灶灶中的陽性表達(dá)率為62.90%，高于癌旁組織的陽性表達(dá)率，高于配對癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中癌組織的陽性表達(dá)率(P=0.041，P=0.007)(表2)。

表1 RAD51蛋白在食管鱗癌及癌旁組織中的表達(dá)

表2 XRCC4蛋白食管鱗癌及癌旁組織中的表達(dá)

2.3 RAD51、XRCC4蛋白的表達(dá)水平與患者臨床病理指標(biāo)之間均無明顯相關(guān)，除了RAD51在女性中的陽性表達(dá)高于男性 RAD51在女性中的陽性表達(dá)高于男性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.022)，在低分化中的陽性表達(dá)率高于在高中分化中的陽性表達(dá)率，患者年齡≥50歲的陽性表達(dá)高于<50歲的陽性表達(dá)，腫瘤最大徑≥4 cm的陽性表達(dá)高于最大徑<4 cm的陽性表達(dá)，浸潤深達(dá)全層的陽性表達(dá)低于其他組，不同P-TNM分期陽性表達(dá)不同，分期越早陽性表達(dá)率越高，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.079，P=1.000，P=0.409，P=0.743，P=0.649)。XRCC4蛋白在男性中的陽性表達(dá)高于女性，患者年齡≥50歲的陽性表達(dá)高于<50歲的陽性表達(dá)，腫瘤最大徑≥4 cm的陽性表達(dá)高于最大徑<4cm的陽性表達(dá)，低分化的陽性表達(dá)高于高中分化的陽性表達(dá)，浸潤深達(dá)全層的陽性表達(dá)低于其他組，不同P-TNM分期陽性表達(dá)不同，分期越晚陽性表達(dá)率越高，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.318，P=0.533，P=0.235，P=0.459，P=0.733，P=0.868)(表3)。

表3 RAD51、XRCC4蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其臨床病理特征

2.4 RAD51、XRCC4蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌中的陽性表達(dá)無相關(guān) 經(jīng)Spearsman等級相關(guān)性分析，RAD51、XRCC4蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌中的陽性表達(dá)無相關(guān)性(r=0.158，P=0.219)。

2.5 RAD51、XRCC4蛋白陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者的PFS無明顯差異 本研究共隨訪到了53例患者，其中 29人已有復(fù)發(fā)，4 人死亡，20人依據(jù)最后一次影像檢查時間定為刪失值。生存分析發(fā)現(xiàn)RAD51蛋白陽性表達(dá)與RAD51蛋白陰性表達(dá)患者的無病進(jìn)展生存期(PFS)無明顯差異(2=0.029，P=0.866)，見圖6；而XRCC4蛋白陽性表達(dá)患者相較XRCC4蛋白陰性表達(dá)能有較好的生存獲益，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(2=2.607，P=0.106)，見圖7。

圖6 RAD51蛋白陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者的PFS分析

圖7 XRCC4蛋白陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者的PFS分析

3 討論

食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，而川東北地區(qū)的閬中市、鹽亭縣等又是我國食管癌的高發(fā)區(qū)。很多原因都可以導(dǎo)致食管癌的發(fā)生，其中DNA雙鏈斷裂(DNA double-Strand-break, DSB)發(fā)揮了重要作用。 DSB是細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷，如果不修復(fù)，可導(dǎo)致染色體丟失和/或細(xì)胞死亡，如果修復(fù)不當(dāng)會引起基因突變和染色體重排，從而使生物體易患免疫缺陷，神經(jīng)損傷和癌癥[11]；修復(fù)DNA 雙鏈斷裂的NHEJ途徑只基于斷裂末端的結(jié)構(gòu)而容易出錯，可以導(dǎo)致DSB 位點短缺、大的缺失或染色體重排，與NHEJ相比HR途徑更精準(zhǔn)，但也可以觸發(fā)染色體易位[12]。

據(jù)報道，RAD51 蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、乳腺癌、上皮性卵巢癌患者中過度表達(dá)[13-16]，XRCC4也與食管癌、膀胱癌、星形細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[17-19]。我們實驗結(jié)果顯示RAD51、XRCC4蛋白在食管鱗癌細(xì)胞系TE-1中均呈陽性表達(dá)，在食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)水平相較癌旁組織均顯著上調(diào)。本研究臨床病理特征分析顯示，年齡越高、腫瘤直徑越大、分化程度越低，RAD51、XRCC4蛋白陽性表達(dá)率越高的趨勢，但可能由于本實驗樣本量較少，后期將增大樣本量，以驗證RAD51蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系，尤其發(fā)現(xiàn)RAD51蛋白在女性患者中的陽性率高于男性(P<0.05)，分析可能與女性患者中組織學(xué)分類以低分化為主有關(guān)，進(jìn)一步說明RAD51蛋白表達(dá)水平可能與腫瘤分化程度有關(guān)，分化越低，陽性表達(dá)越強?？傊覀兊膶嶒灲Y(jié)果表明RAD51、XRCC4蛋白可能參與了食管鱗癌的發(fā)生和進(jìn)展。選擇NHEJ還是HR途徑的關(guān)鍵在于斷裂末端的切除處理[20]，NHEJ 修復(fù)的抑制促進(jìn)了基于 HR 的精準(zhǔn)修復(fù)[21-22]。比較RAD51、XRCC4蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌中的陽性表達(dá)率，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明兩者可能相互配合，共同參與DSB。Spearman等級相關(guān)檢驗顯示兩者無相關(guān)性，也可能和實驗樣本較少有關(guān)。

RAD51 過表達(dá)與淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[23-24]。我們的實驗數(shù)據(jù)顯示 RAD51、XRCC4蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)水平高于配對癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中癌組織(均P<0.05)，兩者可能起著抑制食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移作用。有研究顯示，與RAD51陽性表達(dá)的患者相比，RAD51陰性表達(dá)患者PFS 顯著延長[25]，XRCC4 與星形細(xì)胞瘤預(yù)后不良相關(guān)[26]。生存分析顯示RAD51、XRCC4蛋白陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者的PFS無明顯差異，分析可能與實驗病例數(shù)較少，后期將加大病例量以進(jìn)一步揭示RAD51、XRCC4蛋白表達(dá)在食管鱗癌中的生存意義。以上這些數(shù)據(jù)表明，我們一直認(rèn)為修復(fù)DNA損傷的蛋白可能在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、生存預(yù)后等方面起著重要作用，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步驗證。

4 結(jié)論

RAD51、XRCC4蛋白參與了食管鱗癌的發(fā)病機(jī)制、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并可能和預(yù)后相關(guān)，是潛在的食管鱗癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。