牛樂(lè) 岳江濤 馮凱隆 梅江濤 賈曉康 戴先文

(西安市長(zhǎng)安醫(yī)院骨科，陜西 西安 710016)

臨床上40%的癌癥骨轉(zhuǎn)移患者會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的骨癌痛(bone cancer pain, BCP)。BCP慢性遷延，逐漸加重，許多患者因病情惡化出現(xiàn)焦慮、失眠及抑郁，甚至自殺傾向，臨床上針對(duì)BCP尚缺乏安全有效的藥物干預(yù)和治療手段[1-2]。BCP嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，因而闡明其病理生理機(jī)制，研發(fā)特效鎮(zhèn)痛藥及新型治療方法迫在眉睫[3]。內(nèi)嗎啡肽2(endomorphin-2, EM2)是μ型阿片受體(mu-opioid receptor, MOR)的內(nèi)源性配體和嗎啡的內(nèi)源性類似物，具有比嗎啡更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，而副作用極小[4-6]。脊髓背角是痛覺(jué)傳遞的閘門和初級(jí)中樞，來(lái)源于背根節(jié)神經(jīng)元的EM2濃集分布于脊髓背角。脊髓水平EM2在神經(jīng)病理性痛的調(diào)控中發(fā)揮著極為關(guān)鍵的作用[7-8]。BCP被公認(rèn)是一種神經(jīng)病理性痛，但以往缺乏報(bào)道BCP與脊髓EM2的關(guān)聯(lián)性。本實(shí)驗(yàn)以BCP大鼠模型為工具，以脊髓背角為靶點(diǎn)，綜合運(yùn)用形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、痛覺(jué)行為學(xué)及藥理行為學(xué)等方法研究脊髓背角EM2的表達(dá)變化及其與BCP行為的關(guān)聯(lián)性，從全新的角度探尋BCP的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，購(gòu)自于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量200～220 g。本實(shí)驗(yàn)一切操作均遵循德國(guó)齊默爾曼教授提倡的善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)際公約[9]，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 30只大鼠隨機(jī)分為骨癌痛(BCP)組，假手術(shù)(sham)組和空白對(duì)照組，每組10只?？瞻讓?duì)照組不經(jīng)任何處理，BCP組在大鼠脛骨上端骨髓腔內(nèi)注入Walker256癌細(xì)胞造模，sham組在脛骨相同部位注射等量無(wú)菌生理鹽水。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 每組大鼠在骨髓腔注射癌細(xì)胞之前及之后的3、5、7、10、14、17、21 d先進(jìn)行痛覺(jué)行為學(xué)檢測(cè)，然后在以上各個(gè)時(shí)間點(diǎn)利用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)和免疫組化染色檢測(cè)脊髓EM2的表達(dá)變化。在BCP大鼠痛覺(jué)閾值最低的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行行為藥理學(xué)檢測(cè)，即經(jīng)椎管鞘內(nèi)注入不同劑量的嗎啡、EM2或μ型阿片受體拮抗劑β-FNA，然后記錄痛覺(jué)閾值的變化。

1.2.3 建立動(dòng)物模型 骨癌痛模型建立[10-12]:參照以往經(jīng)典造模方法，經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥(50 mg/kg)淺麻醉大鼠，局部碘伏消毒，取左側(cè)脛骨上端0.5 cm縱行切口，頓性分離皮下組織，暴露脛骨粗隆，10 mL注射器針頭與骨面呈45°向遠(yuǎn)心端方向穿刺打孔，用微量進(jìn)樣器抽取Walker256癌細(xì)胞懸液10 μL，由穿刺孔將癌細(xì)胞緩慢注射至骨髓腔內(nèi)，出針后迅速用骨蠟封閉骨孔，稀釋碘伏液及無(wú)菌生理鹽水沖洗傷口3遍，縫合后外涂紅霉素軟膏?？瞻讓?duì)照組不經(jīng)任何處理，sham組與BCP組采用相同的麻醉和手術(shù)方式，最后在脛骨骨髓腔內(nèi)注射等量無(wú)菌生理鹽水。造模后14天，取大鼠脛骨組織行HE染色，鑒定癌細(xì)胞對(duì)骨質(zhì)破壞情況。

1.2.4 痛覺(jué)閾值檢測(cè) 將大鼠置于鐵絲網(wǎng)之上，透明有機(jī)玻璃罩之內(nèi)，適應(yīng)15 min，然后以von Frey纖維絲(購(gòu)自美國(guó)Stoelting公司)由弱到強(qiáng)刺激足底，每個(gè)刺激強(qiáng)度重復(fù)10次，出現(xiàn)5次以上縮足反射視為陽(yáng)性反應(yīng)，痛覺(jué)閾值為出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的最小刺激強(qiáng)度[13-14]。

1.2.5 HPLC量化分析EM2表達(dá)量 高效液相色譜法(HPLC) 至今尚未發(fā)現(xiàn)編碼EM2的RNA及DNA，且EM2只是四肽，分子量極小，不足1 kDa，無(wú)法使用實(shí)時(shí)定量PCR或者Western blot的方法定量分析,只能用HPLC量化分析EM2表達(dá)量。深麻動(dòng)物，迅速取出脊髓腰膨大節(jié)段，液氮凍存; 裂解液與組織塊混合，經(jīng)超聲裂解，超高速離心后取上清。Hypersil ODS 填料色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm,購(gòu)自美國(guó) Termo Electron 公司)，柱溫 40℃；進(jìn)樣量 10 μL，流動(dòng)相：甲醇-0.1%三乙胺溶液(65∶35)，流速：1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：570 nm[15]。

1.2.6 免疫組化染色 深麻大鼠，暴露心臟，剪開(kāi)右心耳放血，插管至主動(dòng)脈，先以磷酸緩沖液(PB)沖洗組織內(nèi)殘留血液，再以4%多聚甲醛灌注固定30 min。隨后切取脊髓腰膨大節(jié)段，移入含30%蔗糖的PB過(guò)夜。恒冷切片機(jī)切片，片厚25 μm。磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗切片3次，用兔抗EM2 IgG(AB5104, 1∶200; 免疫組化試劑購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司)室溫下孵育切片12 h；生物素化的二抗室溫孵育6 h；A、B混合液(1∶200) 室溫孵育2 h。上述各免疫反應(yīng)步驟之間均用PBS徹底漂洗，最后以0.05% DAB呈色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片，顯微鏡攝片。

1.2.7 行為藥理學(xué) 鞘內(nèi)置管：BCP組，經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥(50 mg/kg)淺麻醉大鼠，局部碘伏消毒，在第4或5胸椎水平沿棘突取0.5 cm縱行切口，頓性分離皮下組織，暴露椎骨，咬去小部分椎板，剪開(kāi)硬脊膜，將PE-10細(xì)導(dǎo)管插入蛛網(wǎng)膜下腔，導(dǎo)管直達(dá)腰膨大(L5～L6節(jié)段)處，見(jiàn)有腦脊液流出，灼燒封閉導(dǎo)管外口，稀釋碘伏液及無(wú)菌生理鹽水沖洗傷口3遍，縫合后外涂紅霉素軟膏。若大鼠清醒后后肢無(wú)運(yùn)動(dòng)障礙，并且以2%利多卡因鞘內(nèi)注射，雙后肢在5秒內(nèi)癱軟，即為置管成功[16-17]。鞘內(nèi)給藥：BCP組，鞘內(nèi)給與嗎啡(0.3、1、3、10 μg)、EM2 (0.3、1、3、10 μg)或β-FNA (1、10 μg)，溶劑對(duì)照組給予相當(dāng)量的無(wú)菌生理鹽水，然后檢測(cè)痛覺(jué)閾值。

2 結(jié)果

2.1 BCP大鼠形成了顯著的機(jī)械性異常疼痛 5天時(shí)，與sham組(26.2±1.6)g和空白對(duì)照組(25.8±1.7)g相比，BCP組痛覺(jué)閾值在脛骨骨髓腔移植腫瘤細(xì)胞后顯著降低(14.8±1.9 )g，14天時(shí)達(dá)到最低值(5.3±1.4 )g，即形成了顯著的機(jī)械性異常疼痛，并且14天之后最低值一直維持下去；而sham組和空白對(duì)照組痛覺(jué)閾值在造模前和造模后無(wú)明顯變化 (P<0.05)，見(jiàn)圖1。HE染色觀察到sham組大鼠脛骨骨質(zhì)致密，結(jié)構(gòu)完整，而B(niǎo)CP組大鼠脛骨骨質(zhì)出現(xiàn)了明顯的侵蝕性破壞(圖2) 。

圖1 骨癌痛大鼠出現(xiàn)了顯著的機(jī)械性異常疼痛

圖2 HE染色示骨癌痛大鼠脛骨出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)破壞

2.2 BCP大鼠脊髓EM2顯著減少，與痛覺(jué)閾值的降低呈正相關(guān) 與sham組和空白對(duì)照組相比，BCP組脊髓背角EM2的染色密度顯著減低，EM2免疫組化陽(yáng)性結(jié)構(gòu)集中在脊髓背角淺層(圖3A)。HPLC檢測(cè)顯示，5天時(shí)，與sham組 (80±4.8 ng/mg)和空白對(duì)照組 (82±4.2 ng/mg)相比，BCP組脊髓EM2的表達(dá)在造模后出現(xiàn)了顯著減少(52±7.3) ng/mg，14天時(shí)減少到最低水平(23±3.6 ng/mg)，并且14天之后最低水平一直維持下去(P<0.05)，見(jiàn)圖3B。在BCP組，痛覺(jué)閾值的降低與EM2的表達(dá)減少呈顯著的正相關(guān) (r=0.963，P<0.001)，見(jiàn)圖3C。以上結(jié)果提示BCP大鼠脊髓背角EM2的表達(dá)下調(diào)對(duì)于痛覺(jué)信息的調(diào)控至關(guān)重要。

圖3 大鼠脊髓EM2顯著減少，與痛覺(jué)閾值的降低密切關(guān)聯(lián)

2.3 脊髓EM2低表達(dá)導(dǎo)致了BCP痛敏狀態(tài)的形成 在BCP組痛覺(jué)閾值的最低點(diǎn)，即造模后14 天，經(jīng)鞘內(nèi)給予嗎啡或EM2都能劑量依賴地產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用(圖4A、B)，但與相當(dāng)劑量的嗎啡相比，EM2能產(chǎn)生更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用(圖4C)，而鞘內(nèi)給予μ型阿片受體拮抗劑β-FNA能夠加深疼痛(圖4D)。以上結(jié)果提示BCP大鼠脊髓背角EM2的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致內(nèi)源性鎮(zhèn)痛作用的減弱，最終增強(qiáng)疼痛信息傳遞，導(dǎo)致BCP組痛覺(jué)行為的形成。

圖4 脊髓EM2低表達(dá)導(dǎo)致了骨癌痛的產(chǎn)生

3 討論

許多惡性腫瘤，如肺癌、乳腺癌、前列腺癌等常伴有骨轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致骨質(zhì)的侵蝕性破壞和骨癌痛(bone cancer pain，BCP)；BCP經(jīng)久不愈，慢性遷延，常表現(xiàn)為異常疼痛、痛覺(jué)過(guò)敏或自發(fā)痛[1-3]?？纱?、嗎啡等阿片類鎮(zhèn)痛藥是臨床上治療BCP的常用藥物，但這些藥物會(huì)帶來(lái)諸多不良反應(yīng)，如便秘、呼吸抑制、惡心、嘔吐等，長(zhǎng)期使用容易產(chǎn)生耐受性和成癮性[18-19]。BCP嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，因而闡明其病理生理機(jī)制，研發(fā)特效鎮(zhèn)痛藥及新型治療方法迫在眉睫[20]。以往對(duì)BCP的研究聚焦在外周神經(jīng)末梢的病變，而本研究獨(dú)辟蹊徑，率先提出中樞脊髓水平EM2的表達(dá)降低導(dǎo)致了BCP的形成，為BCP的防治提供新的靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。

經(jīng)大鼠脛骨上端骨髓腔內(nèi)注入Walker 256癌細(xì)胞建立的BCP大鼠模型是國(guó)際公認(rèn)的研究BCP的動(dòng)物模型[10-12]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們成功建立了該模型。在BCP組大鼠，癌細(xì)胞注入脛骨后大鼠出現(xiàn)了顯著的機(jī)械性異常疼痛，并且疼痛穩(wěn)定維持，而HE染色提示BCP組大鼠脛骨骨質(zhì)出現(xiàn)了明顯的侵蝕性破壞。

以往觀點(diǎn)認(rèn)為，外周神經(jīng)末梢的炎性變性和神經(jīng)突觸內(nèi)線粒體的病變是BCP發(fā)病的主要原因，然而近年來(lái)越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(大腦和脊髓)的病變對(duì)于BCP的發(fā)病同樣起著至關(guān)重要的作用[21]。脊髓背角是痛覺(jué)傳遞的初級(jí)中樞和閘門。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)BCP大鼠脊髓背角神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率顯著增加，同時(shí)脊髓背角谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)顯著下調(diào)，這說(shuō)明骨癌痛狀態(tài)下痛覺(jué)信息在脊髓水平的傳遞出現(xiàn)了中樞敏化和增強(qiáng)[22-23]。內(nèi)嗎啡肽(endomorphin，EM)是最新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性阿片肽，包括內(nèi)嗎啡肽1(endomorphin-1; EM1)和內(nèi)嗎啡肽2(endomorphin-2，EM2)。EM作為內(nèi)源性物質(zhì)，具有比嗎啡更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，而副作用極小[4-8]。EM2濃集分布于脊髓背角，脊髓EM2在神經(jīng)病理性痛的誘導(dǎo)和維系中起著極為重要的作用，外周神經(jīng)損傷可導(dǎo)致脊髓背角EM2的表達(dá)顯著減少[24]，鞘內(nèi)或全身注射EM2對(duì)神經(jīng)病理性痛起到有效的鎮(zhèn)痛作用[25]。本研究從新的切入點(diǎn)，即脊髓水平探索BCP的發(fā)病機(jī)理，發(fā)現(xiàn)BCP大鼠脊髓背角EM2的染色密度顯著減小，表達(dá)水平顯著下調(diào)，EM2的表達(dá)下調(diào)和痛覺(jué)閾值的減低呈顯著正相關(guān)，經(jīng)鞘內(nèi)注射EM2能產(chǎn)生比嗎啡更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用。

4 結(jié)論

脊髓背角EM2的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致了BCP大鼠痛敏狀態(tài)的形成，從全新的角度詮釋BCP形成的病理生理機(jī)制，為BCP診療提供了新的理論依據(jù)。