牛樂 岳江濤 馮凱隆 梅江濤 賈曉康 戴先文

(西安市長安醫(yī)院骨科，陜西 西安 710016)

臨床上40%的癌癥骨轉(zhuǎn)移患者會出現(xiàn)嚴重的骨癌痛(bone cancer pain, BCP)。BCP慢性遷延，逐漸加重，許多患者因病情惡化出現(xiàn)焦慮、失眠及抑郁，甚至自殺傾向，臨床上針對BCP尚缺乏安全有效的藥物干預和治療手段[1-2]。BCP嚴重影響患者的生存質(zhì)量，因而闡明其病理生理機制，研發(fā)特效鎮(zhèn)痛藥及新型治療方法迫在眉睫[3]。內(nèi)嗎啡肽2(endomorphin-2, EM2)是μ型阿片受體(mu-opioid receptor, MOR)的內(nèi)源性配體和嗎啡的內(nèi)源性類似物，具有比嗎啡更強的鎮(zhèn)痛作用，而副作用極小[4-6]。脊髓背角是痛覺傳遞的閘門和初級中樞，來源于背根節(jié)神經(jīng)元的EM2濃集分布于脊髓背角。脊髓水平EM2在神經(jīng)病理性痛的調(diào)控中發(fā)揮著極為關(guān)鍵的作用[7-8]。BCP被公認是一種神經(jīng)病理性痛，但以往缺乏報道BCP與脊髓EM2的關(guān)聯(lián)性。本實驗以BCP大鼠模型為工具，以脊髓背角為靶點，綜合運用形態(tài)學、生物化學、痛覺行為學及藥理行為學等方法研究脊髓背角EM2的表達變化及其與BCP行為的關(guān)聯(lián)性，從全新的角度探尋BCP的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年SPF級雄性SD大鼠30只，購自于空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，體質(zhì)量200～220 g。本實驗一切操作均遵循德國齊默爾曼教授提倡的善待實驗動物國際公約[9]，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 30只大鼠隨機分為骨癌痛(BCP)組，假手術(shù)(sham)組和空白對照組，每組10只?？瞻讓φ战M不經(jīng)任何處理，BCP組在大鼠脛骨上端骨髓腔內(nèi)注入Walker256癌細胞造模，sham組在脛骨相同部位注射等量無菌生理鹽水。

1.2.2 實驗設(shè)計 每組大鼠在骨髓腔注射癌細胞之前及之后的3、5、7、10、14、17、21 d先進行痛覺行為學檢測，然后在以上各個時間點利用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)和免疫組化染色檢測脊髓EM2的表達變化。在BCP大鼠痛覺閾值最低的時間點進行行為藥理學檢測，即經(jīng)椎管鞘內(nèi)注入不同劑量的嗎啡、EM2或μ型阿片受體拮抗劑β-FNA，然后記錄痛覺閾值的變化。

1.2.3 建立動物模型 骨癌痛模型建立[10-12]:參照以往經(jīng)典造模方法，經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥(50 mg/kg)淺麻醉大鼠，局部碘伏消毒，取左側(cè)脛骨上端0.5 cm縱行切口，頓性分離皮下組織，暴露脛骨粗隆，10 mL注射器針頭與骨面呈45°向遠心端方向穿刺打孔，用微量進樣器抽取Walker256癌細胞懸液10 μL，由穿刺孔將癌細胞緩慢注射至骨髓腔內(nèi)，出針后迅速用骨蠟封閉骨孔，稀釋碘伏液及無菌生理鹽水沖洗傷口3遍，縫合后外涂紅霉素軟膏?？瞻讓φ战M不經(jīng)任何處理，sham組與BCP組采用相同的麻醉和手術(shù)方式，最后在脛骨骨髓腔內(nèi)注射等量無菌生理鹽水。造模后14天，取大鼠脛骨組織行HE染色，鑒定癌細胞對骨質(zhì)破壞情況。

1.2.4 痛覺閾值檢測 將大鼠置于鐵絲網(wǎng)之上，透明有機玻璃罩之內(nèi)，適應15 min，然后以von Frey纖維絲(購自美國Stoelting公司)由弱到強刺激足底，每個刺激強度重復10次，出現(xiàn)5次以上縮足反射視為陽性反應，痛覺閾值為出現(xiàn)陽性反應的最小刺激強度[13-14]。

1.2.5 HPLC量化分析EM2表達量 高效液相色譜法(HPLC) 至今尚未發(fā)現(xiàn)編碼EM2的RNA及DNA，且EM2只是四肽，分子量極小，不足1 kDa，無法使用實時定量PCR或者Western blot的方法定量分析,只能用HPLC量化分析EM2表達量。深麻動物，迅速取出脊髓腰膨大節(jié)段，液氮凍存; 裂解液與組織塊混合，經(jīng)超聲裂解，超高速離心后取上清。Hypersil ODS 填料色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm,購自美國 Termo Electron 公司)，柱溫 40℃；進樣量 10 μL，流動相：甲醇-0.1%三乙胺溶液(65∶35)，流速：1.0 mL/min，檢測波長：570 nm[15]。

1.2.6 免疫組化染色 深麻大鼠，暴露心臟，剪開右心耳放血，插管至主動脈，先以磷酸緩沖液(PB)沖洗組織內(nèi)殘留血液，再以4%多聚甲醛灌注固定30 min。隨后切取脊髓腰膨大節(jié)段，移入含30%蔗糖的PB過夜。恒冷切片機切片，片厚25 μm。磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗切片3次，用兔抗EM2 IgG(AB5104, 1∶200; 免疫組化試劑購自美國Chemicon公司)室溫下孵育切片12 h；生物素化的二抗室溫孵育6 h；A、B混合液(1∶200) 室溫孵育2 h。上述各免疫反應步驟之間均用PBS徹底漂洗，最后以0.05% DAB呈色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片，顯微鏡攝片。

1.2.7 行為藥理學 鞘內(nèi)置管：BCP組，經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥(50 mg/kg)淺麻醉大鼠，局部碘伏消毒，在第4或5胸椎水平沿棘突取0.5 cm縱行切口，頓性分離皮下組織，暴露椎骨，咬去小部分椎板，剪開硬脊膜，將PE-10細導管插入蛛網(wǎng)膜下腔，導管直達腰膨大(L5～L6節(jié)段)處，見有腦脊液流出，灼燒封閉導管外口，稀釋碘伏液及無菌生理鹽水沖洗傷口3遍，縫合后外涂紅霉素軟膏。若大鼠清醒后后肢無運動障礙，并且以2%利多卡因鞘內(nèi)注射，雙后肢在5秒內(nèi)癱軟，即為置管成功[16-17]。鞘內(nèi)給藥：BCP組，鞘內(nèi)給與嗎啡(0.3、1、3、10 μg)、EM2 (0.3、1、3、10 μg)或β-FNA (1、10 μg)，溶劑對照組給予相當量的無菌生理鹽水，然后檢測痛覺閾值。

2 結(jié)果

2.1 BCP大鼠形成了顯著的機械性異常疼痛 5天時，與sham組(26.2±1.6)g和空白對照組(25.8±1.7)g相比，BCP組痛覺閾值在脛骨骨髓腔移植腫瘤細胞后顯著降低(14.8±1.9 )g，14天時達到最低值(5.3±1.4 )g，即形成了顯著的機械性異常疼痛，并且14天之后最低值一直維持下去；而sham組和空白對照組痛覺閾值在造模前和造模后無明顯變化 (P<0.05)，見圖1。HE染色觀察到sham組大鼠脛骨骨質(zhì)致密，結(jié)構(gòu)完整，而BCP組大鼠脛骨骨質(zhì)出現(xiàn)了明顯的侵蝕性破壞(圖2) 。

圖1 骨癌痛大鼠出現(xiàn)了顯著的機械性異常疼痛

圖2 HE染色示骨癌痛大鼠脛骨出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)破壞

2.2 BCP大鼠脊髓EM2顯著減少，與痛覺閾值的降低呈正相關(guān) 與sham組和空白對照組相比，BCP組脊髓背角EM2的染色密度顯著減低，EM2免疫組化陽性結(jié)構(gòu)集中在脊髓背角淺層(圖3A)。HPLC檢測顯示，5天時，與sham組 (80±4.8 ng/mg)和空白對照組 (82±4.2 ng/mg)相比，BCP組脊髓EM2的表達在造模后出現(xiàn)了顯著減少(52±7.3) ng/mg，14天時減少到最低水平(23±3.6 ng/mg)，并且14天之后最低水平一直維持下去(P<0.05)，見圖3B。在BCP組，痛覺閾值的降低與EM2的表達減少呈顯著的正相關(guān) (r=0.963，P<0.001)，見圖3C。以上結(jié)果提示BCP大鼠脊髓背角EM2的表達下調(diào)對于痛覺信息的調(diào)控至關(guān)重要。

圖3 大鼠脊髓EM2顯著減少，與痛覺閾值的降低密切關(guān)聯(lián)

2.3 脊髓EM2低表達導致了BCP痛敏狀態(tài)的形成 在BCP組痛覺閾值的最低點，即造模后14 天，經(jīng)鞘內(nèi)給予嗎啡或EM2都能劑量依賴地產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用(圖4A、B)，但與相當劑量的嗎啡相比，EM2能產(chǎn)生更強的鎮(zhèn)痛作用(圖4C)，而鞘內(nèi)給予μ型阿片受體拮抗劑β-FNA能夠加深疼痛(圖4D)。以上結(jié)果提示BCP大鼠脊髓背角EM2的表達下調(diào)導致內(nèi)源性鎮(zhèn)痛作用的減弱，最終增強疼痛信息傳遞，導致BCP組痛覺行為的形成。

圖4 脊髓EM2低表達導致了骨癌痛的產(chǎn)生

3 討論

許多惡性腫瘤，如肺癌、乳腺癌、前列腺癌等常伴有骨轉(zhuǎn)移，導致骨質(zhì)的侵蝕性破壞和骨癌痛(bone cancer pain，BCP)；BCP經(jīng)久不愈，慢性遷延，常表現(xiàn)為異常疼痛、痛覺過敏或自發(fā)痛[1-3]?？纱?、嗎啡等阿片類鎮(zhèn)痛藥是臨床上治療BCP的常用藥物，但這些藥物會帶來諸多不良反應，如便秘、呼吸抑制、惡心、嘔吐等，長期使用容易產(chǎn)生耐受性和成癮性[18-19]。BCP嚴重影響患者的生存質(zhì)量，因而闡明其病理生理機制，研發(fā)特效鎮(zhèn)痛藥及新型治療方法迫在眉睫[20]。以往對BCP的研究聚焦在外周神經(jīng)末梢的病變，而本研究獨辟蹊徑，率先提出中樞脊髓水平EM2的表達降低導致了BCP的形成，為BCP的防治提供新的靶點和理論基礎(chǔ)。

經(jīng)大鼠脛骨上端骨髓腔內(nèi)注入Walker 256癌細胞建立的BCP大鼠模型是國際公認的研究BCP的動物模型[10-12]。在本實驗中，我們成功建立了該模型。在BCP組大鼠，癌細胞注入脛骨后大鼠出現(xiàn)了顯著的機械性異常疼痛，并且疼痛穩(wěn)定維持，而HE染色提示BCP組大鼠脛骨骨質(zhì)出現(xiàn)了明顯的侵蝕性破壞。

以往觀點認為，外周神經(jīng)末梢的炎性變性和神經(jīng)突觸內(nèi)線粒體的病變是BCP發(fā)病的主要原因，然而近年來越來越多的學者認為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(大腦和脊髓)的病變對于BCP的發(fā)病同樣起著至關(guān)重要的作用[21]。脊髓背角是痛覺傳遞的初級中樞和閘門。有學者發(fā)現(xiàn)BCP大鼠脊髓背角神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率顯著增加，同時脊髓背角谷氨酸轉(zhuǎn)運體的表達顯著下調(diào)，這說明骨癌痛狀態(tài)下痛覺信息在脊髓水平的傳遞出現(xiàn)了中樞敏化和增強[22-23]。內(nèi)嗎啡肽(endomorphin，EM)是最新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性阿片肽，包括內(nèi)嗎啡肽1(endomorphin-1; EM1)和內(nèi)嗎啡肽2(endomorphin-2，EM2)。EM作為內(nèi)源性物質(zhì)，具有比嗎啡更強的鎮(zhèn)痛作用，而副作用極小[4-8]。EM2濃集分布于脊髓背角，脊髓EM2在神經(jīng)病理性痛的誘導和維系中起著極為重要的作用，外周神經(jīng)損傷可導致脊髓背角EM2的表達顯著減少[24]，鞘內(nèi)或全身注射EM2對神經(jīng)病理性痛起到有效的鎮(zhèn)痛作用[25]。本研究從新的切入點，即脊髓水平探索BCP的發(fā)病機理，發(fā)現(xiàn)BCP大鼠脊髓背角EM2的染色密度顯著減小，表達水平顯著下調(diào)，EM2的表達下調(diào)和痛覺閾值的減低呈顯著正相關(guān)，經(jīng)鞘內(nèi)注射EM2能產(chǎn)生比嗎啡更強的鎮(zhèn)痛作用。

4 結(jié)論

脊髓背角EM2的表達下調(diào)導致了BCP大鼠痛敏狀態(tài)的形成，從全新的角度詮釋BCP形成的病理生理機制，為BCP診療提供了新的理論依據(jù)。