吳 夢(mèng)， 鄒賢剛， 劉作華， 楊松全， 葛良鵬,4

(1. 重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2. 農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460；3.養(yǎng)豬科學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460；4. 重慶市醫(yī)用動(dòng)物資源開(kāi)發(fā)與轉(zhuǎn)化應(yīng)用工程技術(shù)中心，重慶 402460；5. 重慶金邁博生物科技有限公司，重慶 402460)

抗體藥物是人類(lèi)醫(yī)學(xué)史上重大發(fā)明之一，在重大疾病治療和生物安全防控方面發(fā)揮著重要的作用。作為開(kāi)發(fā)全人抗體的核心工具動(dòng)物，人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)在抗體藥物研發(fā)過(guò)程中有著重要的作用，因此對(duì)人源抗體動(dòng)物的培育及其核心專(zhuān)利的保護(hù)尤為重要。本文重點(diǎn)介紹了幾種常用人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系以及它們的核心專(zhuān)利保護(hù)，并對(duì)其應(yīng)用和發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了分析和展望。

1 治療性抗體藥物的人源化程度和基本類(lèi)型

抗體藥物的發(fā)展經(jīng)歷了鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人抗體等不同發(fā)展階段(圖1)，其人源化程度和質(zhì)量隨科學(xué)發(fā)展不斷提高，全人抗體是由人類(lèi)免疫球蛋白基因DNA(deoxyribo nucleic acid, 脫氧核糖核酸)表達(dá)產(chǎn)生，因此其安全性、有效性較之前的抗體藥物進(jìn)一步提升，是當(dāng)前和未來(lái)抗體藥物發(fā)展的重點(diǎn)[1-2]。

抗體模擬圖：綠色表示鼠抗體，紅色表示人抗體，黃線(xiàn)表示鼠CDR區(qū)，藍(lán)線(xiàn)表示人CDR區(qū)。圖1 抗體藥物的發(fā)展歷程和抗體藥物的類(lèi)型Figure 1 Development and format of therapeutic antibody drugs

人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是開(kāi)發(fā)全人抗體的主流技術(shù)之一，截至2020年10月，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)累計(jì)批準(zhǔn)32個(gè)全人抗體藥物，其中23個(gè)(約72%)是由人源抗體轉(zhuǎn)基因小鼠平臺(tái)開(kāi)發(fā)而來(lái)(表1)，余下的9個(gè)(28%)來(lái)源于噬菌體展示平臺(tái)。一般來(lái)說(shuō)，噬菌體展示技術(shù)是“先快后慢”，即找到特異性的抗體速度較快，但得到的抗體往往親和力不高，需要進(jìn)行氨基酸突變來(lái)提高親和力；然而優(yōu)化會(huì)有改變抗體空間結(jié)構(gòu)的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致抗體活性丟失，且在優(yōu)化的過(guò)程中也會(huì)帶來(lái)免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)。人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)則是“先慢后快”，即抗原免疫小鼠、產(chǎn)生特異抗體、雜交瘤融合和篩選等步驟可能需要幾個(gè)月的時(shí)間，但由于抗體的產(chǎn)生過(guò)程是在小鼠體內(nèi)完成，容易篩選獲得高親和力的候選抗體同時(shí)由于經(jīng)過(guò)動(dòng)物體內(nèi)的自然篩選，留下的抗體綜合性能更為優(yōu)異。Jain等[3]對(duì)已經(jīng)批準(zhǔn)上市和正在開(kāi)展臨床研究的全人抗體做了全面分析，結(jié)果顯示：人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)與噬菌體展示技術(shù)相比，利用人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)開(kāi)發(fā)的全人抗體藥物具有更好的成藥性。

表1 FDA已批準(zhǔn)上市全人抗體藥物及其來(lái)源的人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)

2 人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)

人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育的基本技術(shù)路線(xiàn)是將人的部分、全部或者經(jīng)過(guò)修飾后的免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)入到動(dòng)物體內(nèi)，從而代替動(dòng)物內(nèi)源性抗體的表達(dá)。其可以通過(guò)以下兩個(gè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)方案來(lái)完成：一是在敲除動(dòng)物內(nèi)源免疫球蛋白基因的關(guān)鍵基因片段的基礎(chǔ)上，將人的免疫球蛋白基因隨機(jī)插入(或者同源插入)到動(dòng)物的基因組上；二是用人的免疫球蛋白基因片段[V(variable)、D(diversity)、J(joining)]原位置換動(dòng)物內(nèi)源的免疫球蛋白基因片段(V-、D-、J-)，采用動(dòng)物內(nèi)源的C區(qū)(constant region)和調(diào)控元件，實(shí)現(xiàn)人的免疫球蛋白基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)。但是，由于編碼人抗體的免疫球蛋白基因片段超大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，特別是免疫球蛋白基因的許多DNA序列的功能還不清楚，抗體表達(dá)調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，因此，培育人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)難度巨大，同時(shí)還要考慮已有的人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)相關(guān)專(zhuān)利保護(hù)[4-6]。

人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的培育經(jīng)歷了不同的發(fā)展階段。第一代人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是將部分人源抗體重鏈和κ和/或λ輕鏈轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)，同時(shí)敲除動(dòng)物內(nèi)源的免疫球蛋白重鏈、κ輕鏈和/或λ輕鏈，其代表為L(zhǎng)onberg博士和Larry Green博士?jī)蓚€(gè)團(tuán)隊(duì)分別培育出的HuMAb?小鼠和XenoMouse?小鼠[7-8]；第二代人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在第一代基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了完整人源免疫球蛋白基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)入，使人源抗體重排多樣性得到了保障，其代表為日本麒麟公司培育的TCTMMouse小鼠[9]；第三代人源抗體抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物又在第二代的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)解決人源抗體動(dòng)物B細(xì)胞發(fā)育和免疫性能問(wèn)題，其技術(shù)原理是通過(guò)保留宿主動(dòng)物免疫球蛋白重鏈的C區(qū)或利用B細(xì)胞時(shí)空特異性表達(dá)技術(shù)，解決BCR結(jié)構(gòu)的適配性問(wèn)題，使B細(xì)胞的分化、抗體類(lèi)型轉(zhuǎn)換正常，其代表為KyMouseTM小鼠、VelocImmune?Mouse小鼠和CAMouse?小鼠等[10-12]。目前全球成功培育的主要人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)見(jiàn)表2。

表2 主要的人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)

2.1 XenoMouse?小鼠平臺(tái)

XenoMouse?小鼠平臺(tái)最初由Cell Genesys公司Larry Green博士牽頭培育獲得。1996年XenoMouse?小鼠平臺(tái)從Cell Genesys獨(dú)立出來(lái)成為Abgenix公司，2005年底，Amgen公司以22億美元的價(jià)格收購(gòu)了Abgenix公司。目前利用該平臺(tái)已成功開(kāi)發(fā)了8個(gè)上市抗體藥物(表2)。該小鼠攜帶有大部分人的重鏈(heavy chain)和κ輕鏈(kappa light chain)免疫球蛋白基因序列，包括17個(gè)重鏈VH(variable heavy region)和18個(gè)輕鏈VK(variable kappa region)。同時(shí)敲除了小鼠自身的重鏈和κ輕鏈免疫球蛋白基因，可一次性獲得人IgG。但是其小鼠的B細(xì)胞信號(hào)傳遞存在缺陷導(dǎo)致表達(dá)抗體的漿細(xì)胞數(shù)量少[8]。

2.2 TCTM Mouse小鼠平臺(tái)

TCTMMouse小鼠平臺(tái)是由日本麒麟公司石田功團(tuán)隊(duì)培育獲得。第一代TCTMMouse創(chuàng)新性地利用人的人工染色體技術(shù)(HAC，human artificial chromosome)，將完整的人抗體重鏈和λ輕鏈(lambda light chain)免疫球蛋白基因?qū)肱咛ジ杉?xì)胞中，獲得了該小鼠。由于該小鼠攜帶了一條額外的染色體，導(dǎo)致TCTMMouse的轉(zhuǎn)基因傳代不穩(wěn)定[9]。為了解決第一代TCTMMouse染色體不穩(wěn)定的問(wèn)題，第二代TC-mAbTMMouse改用鼠的人工染色體(MAC, mouse artificial chromosome)，將含有人抗體基因的MAC載體導(dǎo)入含有39條染色體的小鼠胚胎干細(xì)胞，從而獲得正常的胚胎干細(xì)胞，保證了染色體遺傳性狀，經(jīng)多次傳代無(wú)染色體丟失。第二代TC-mAbTMMouse攜帶了完整的人重鏈、κ和λ輕鏈免疫球蛋白基因，同時(shí)敲除了小鼠自身的重鏈和κ輕鏈免疫球蛋白基因，最大限度保證了抗體多樣性。目前利用該平臺(tái)已成功開(kāi)發(fā)了1個(gè)上市抗體藥物(表2),但是，該小鼠存在和XenoMouse?類(lèi)似的問(wèn)題，B細(xì)胞信號(hào)傳遞存在缺陷和表達(dá)抗體的漿細(xì)胞數(shù)量少[13]。

2.3 TCTM Cattle牛平臺(tái)

TCTMCattle牛平臺(tái)是由日本麒麟公司石田功團(tuán)隊(duì)和美國(guó)原Hematech公司的Robl團(tuán)隊(duì)合作培育獲得，現(xiàn)由美國(guó)SAB Biotherapeutics公司擁有并用于研發(fā)治療性單克隆抗體和多克隆抗體[14]。其技術(shù)路線(xiàn)是采用HAC技術(shù)將人的重鏈和輕鏈(稱(chēng)：isKcHACΔ)轉(zhuǎn)入牛的成纖維細(xì)胞，再通過(guò)體細(xì)胞克隆技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因牛，同時(shí)敲除了牛自身的重鏈、κ和λ輕鏈免疫球蛋白基因。但是HAC在基因組中游離存在，相當(dāng)于基因組中多一條微小染色體，在繁殖和體細(xì)胞中不穩(wěn)定，特別是在B細(xì)胞分裂和增殖過(guò)程中容易丟失，影響了BCR的信號(hào)傳遞和B細(xì)胞發(fā)育，其外周血淋巴細(xì)胞(PMBC)的人IgK+和牛IgM+的雙陽(yáng)性B細(xì)胞只有0.9%(正常牛的IgM+陽(yáng)性細(xì)胞大約是20%)[15]。

2.4 HuMab? Mouse小鼠平臺(tái)

HuMab?Mouse小鼠平臺(tái)最初由GenPharm公司的Lonberg博士領(lǐng)銜培育獲得，Medarex公司于1997年收購(gòu)GenPharm公司并獲得了該小鼠平臺(tái)。2000年，Medarex公司與日本麒麟公司建立合作，通過(guò)雜交將HuMAb?Mouse小鼠與TCTMMouse小鼠組合，命名為KMTM小鼠(K代表麒麟，M代表Medarex)，整合了TCTMMouse小鼠人重鏈抗體基因的多樣性與HuMAb?Mouse小鼠κ輕鏈抗體基因的穩(wěn)定性，優(yōu)化了HuMab?Mouse平臺(tái)。2009年BMS公司以24億美元的價(jià)格收購(gòu)了Medarex公司。HuMab?Mouse小鼠經(jīng)過(guò)優(yōu)化，已攜帶全部人重鏈和κ輕鏈免疫球蛋白基因，同時(shí)敲除了小鼠自身的重鏈和κ輕鏈免疫球蛋白基因，可一次性獲得人IgG[7]。目前利用該平臺(tái)已成功開(kāi)發(fā)了9個(gè)上市抗體藥物(表2)。但是，該小鼠也同樣存在B細(xì)胞信號(hào)傳遞有缺陷，表達(dá)抗體的漿細(xì)胞數(shù)量少。

2.5 OmniRat?大鼠平臺(tái)

OmniRat?大鼠平臺(tái)由英國(guó)科學(xué)家Bruggeman博士等牽頭培育獲得，2015年被Ligand公司收購(gòu)并獲得該平臺(tái)的使用權(quán)。該大鼠攜帶有人/大鼠免疫球蛋白重鏈基因，包含24個(gè)人免疫球蛋白重鏈VH、大鼠的C區(qū)和人免疫球蛋白輕鏈[20個(gè)VK、15個(gè)VL(variable lambda region)以及KC(kappa constant region)和LC(lambda constant region)等]，同時(shí)敲除了大鼠自身的重鏈、κ和λ輕鏈免疫球蛋白基因。由于重鏈C區(qū)是大鼠來(lái)源，保證了B細(xì)胞受體的信號(hào)傳遞和抗體表達(dá)的漿細(xì)胞的數(shù)量，但需要對(duì)C區(qū)進(jìn)行Fc置換才能獲得全人抗體[16]。

2.6 Harbour H2L2 TM小鼠平臺(tái)

Harbour H2L2TM小鼠平臺(tái)由荷蘭培育獲得，2016年被和鉑醫(yī)藥收購(gòu)。該小鼠攜帶18個(gè)人免疫球蛋白重鏈VH和11個(gè)人免疫球蛋白輕鏈VK，同時(shí)敲除了小鼠自身的重鏈和κ輕鏈免疫球蛋白基因。Harbour H2L2TM小鼠選擇了部分人利用率較高的人重鏈VH，但由于免疫球蛋白重鏈轉(zhuǎn)基因的C區(qū)來(lái)源于大鼠，同樣需要對(duì)C區(qū)進(jìn)行Fc置換才能獲得全人抗體[17]。

2.7 VelocImmune? Mouse小鼠平臺(tái)

VelocImmune?Mouse小鼠平臺(tái)為美國(guó)Regeneron公司培育獲得。目前該平臺(tái)已成功開(kāi)發(fā)了5個(gè)上市抗體藥物(表2)。該小鼠包含47個(gè)人免疫球蛋白重鏈VH和23個(gè)人免疫球蛋白輕鏈VK，保留了小鼠自身所有的C區(qū)及其它基因表達(dá)調(diào)控元件。VelocImmune?Mouse小鼠是通過(guò)同源重組和原位替換技術(shù)將小鼠免疫球蛋白C區(qū)前端的V(D)J基因精確替換為人免疫球蛋白基因，使該小鼠能夠表達(dá)人抗體的V(D)J基因，由于保留了小鼠自身的C區(qū)，保證了B細(xì)胞信號(hào)傳遞和抗體表達(dá)的漿細(xì)胞的數(shù)量，但需要對(duì)C區(qū)進(jìn)行Fc置換才能獲得全人抗體[10]。

2.8 KyMouseTM小鼠平臺(tái)

KyMouseTM小鼠平臺(tái)由英國(guó)Kymab公司培育獲得。該小鼠同樣是將小鼠重鏈、κ和λ輕鏈免疫球蛋白的V(D)J基因通過(guò)同源插入，內(nèi)源倒置(Cre-LoxP技術(shù))，精確地將人的重鏈和輕鏈免疫球蛋白的V(D)J基因插入到小鼠的C區(qū)前端。它攜帶43個(gè)人免疫球蛋白重鏈VH、37個(gè)人免疫球蛋白輕鏈VK和34個(gè)人免疫球蛋白輕鏈VL；它擁有正常的B細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)，保證了BCR信號(hào)傳遞和抗體表達(dá)的漿細(xì)胞的數(shù)量，但相應(yīng)的也需要對(duì)C區(qū)進(jìn)行Fc置換才能獲得全人抗體[11]。

2.9 MeMo? Mouse小鼠平臺(tái)

MeMo?Mouse小鼠平臺(tái)由荷蘭的Merus公司培育獲得。該小鼠包含人免疫球蛋白重鏈VH，以及重組后的人κ輕鏈基因(common light chain)，同時(shí)敲除了小鼠自身的免疫球蛋白重鏈基因。MeMo?Mouse小鼠產(chǎn)生抗體特點(diǎn)是所有抗體均擁有相同的輕鏈，容易構(gòu)建雙特異性抗體。但由于保留了小鼠自身的C區(qū)，因此也需要對(duì)C區(qū)進(jìn)行Fc置換才能獲得全人抗體[18]。

2.10 AlivaMab Mouse小鼠平臺(tái)

AlivaMab Mouse小鼠平臺(tái)由美國(guó)的Ablexis公司培育獲得。該小鼠是將人免疫球蛋白重鏈、 κ輕鏈和λ輕鏈基因同源插入小鼠C區(qū)的前端，并將小鼠重鏈C區(qū)的CH1和鉸鏈區(qū)序列由人的CH1和鉸鏈區(qū)序列進(jìn)行置換。因此，該小鼠的B細(xì)胞信號(hào)傳遞和漿細(xì)胞的數(shù)量正常，但同樣需要對(duì)C區(qū)進(jìn)行Fc置換才能獲得全人抗體[19]。

2.11 TRIANNI Mouse?小鼠平臺(tái)

TRIANNI Mouse?小鼠平臺(tái)由美國(guó)TRIANNI公司培育獲得。該小鼠攜帶有全部人免疫球蛋白重鏈VH、輕鏈VK和VL，且人免疫球蛋白基因的V(D)J序列是同源插入到鼠源免疫球蛋白基因的C區(qū)前端，小鼠免疫球蛋白λ輕鏈的J區(qū)序列由人的J區(qū)序列同源置換。由于該小鼠平臺(tái)保留了小鼠自身C區(qū)序列，B細(xì)胞信號(hào)傳遞和漿細(xì)胞的數(shù)量正常，但相應(yīng)也需要對(duì)C區(qū)進(jìn)行Fc置換才能獲得全人抗體[20]。

2.12 CAMouse?小鼠平臺(tái)

CAMouse?(China Antibody Mouse)小鼠平臺(tái)由中國(guó)的金邁博公司培育獲得，采取的策略是基因打靶和隨機(jī)插入的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。該小鼠攜帶32個(gè)人抗體重鏈VH，22個(gè)人抗體輕鏈VK和16個(gè)人抗體輕鏈VL，同時(shí)敲除了鼠源免疫球蛋白重鏈和κ輕鏈。CAMouse?小鼠平臺(tái)的特點(diǎn)是在重鏈轉(zhuǎn)基因載體中，包含了結(jié)構(gòu)和序列完整的小鼠IgH 5′-端增強(qiáng)子，小鼠Sμ和IgM序列以及所有的內(nèi)含子和調(diào)控序列等。因此，在淋巴細(xì)胞發(fā)育中，保證了B細(xì)胞信號(hào)傳遞，B細(xì)胞正常發(fā)育，能在小鼠體內(nèi)正常完成IgM到IgG的轉(zhuǎn)換，同時(shí)小鼠的漿細(xì)胞數(shù)量正常，可在體內(nèi)一次性獲得全人抗體[12]。

2.13 RenMabTM平臺(tái)

RenMabTM平臺(tái)由百奧賽圖公司培育獲得， RenMabTM小鼠是將小鼠重鏈和κ輕鏈的V(D)J基因原位置換為人抗體基因，置換大小分別為1.0 Mb和1.6 Mb。由于該小鼠保留了自身的內(nèi)源C區(qū)序列，B細(xì)胞信號(hào)傳遞和漿細(xì)胞的數(shù)量正常，但是需要對(duì)C區(qū)進(jìn)行Fc置換才能獲得全人抗體[24]。

3 人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)相關(guān)的專(zhuān)利

3.1 小鼠免疫球蛋白基因敲除技術(shù)專(zhuān)利

早期的人源抗體轉(zhuǎn)基因小鼠采用隨機(jī)插入人的免疫球蛋白基因，同時(shí)敲除小鼠自身的免疫球蛋白基因技術(shù)方案，這種技術(shù)方案主要涉及小鼠免疫球蛋白基因敲除專(zhuān)利，且大部分已過(guò)期，仍在有效期內(nèi)和重要用途的是2008年Bruggemann博士和鄒賢剛博士申請(qǐng)的小鼠λ輕鏈免疫球蛋白基因敲除專(zhuān)利，該專(zhuān)利核心是對(duì)小鼠內(nèi)源性λ輕鏈的J2-C2和J4-C4區(qū)分別插入一個(gè)篩選基因和LoxP序列，然后通過(guò)Cre-LoxP技術(shù)將J2到C3之間的所有功能性J區(qū)和C區(qū)敲除，從而使小鼠的λ輕鏈?zhǔn)Щ?，該?zhuān)利對(duì)小鼠的λ輕鏈?zhǔn)Щ畹南嚓P(guān)權(quán)利進(jìn)行了全面保護(hù)[22]。目前該專(zhuān)利已轉(zhuǎn)移給Cresendo Biologics公司[23]。

3.2 牛的免疫球蛋白重鏈敲除和轉(zhuǎn)基因改造技術(shù)和專(zhuān)利

2012—2013年，Sanford應(yīng)用生物科學(xué)公司(SAB Biotherapeutics公司的前身)申請(qǐng)了題目為《用于在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中生產(chǎn)人類(lèi)抗體的復(fù)雜的染色體工程》的中國(guó)(CN104755493A)和其他國(guó)家的專(zhuān)利[24]；闡明了牛IgH重鏈與其他哺乳動(dòng)物的不同點(diǎn)，牛IgH重鏈具有兩個(gè)獨(dú)立的IgM表達(dá)和調(diào)控原件。該專(zhuān)利保護(hù)了牛IgM的基因打靶技術(shù)和人免疫球蛋白質(zhì)基因的HAC重鏈載體的修飾技術(shù)。另外，該公司也用同樣的MAC(isKcHACΔ)技術(shù)制備了人源抗體轉(zhuǎn)基因山羊平臺(tái)。

3.3 人免疫球蛋白V(D)J基因原位替換小鼠的免疫球蛋白V(D)J基因的技術(shù)專(zhuān)利

為保障人源抗體轉(zhuǎn)基因小鼠BCR結(jié)構(gòu)和信號(hào)的正常，保障B細(xì)胞正常發(fā)育，通常采用在小鼠免疫球蛋白的C區(qū)前原位插入人免疫球蛋白V(D)J基因，目前相關(guān)專(zhuān)利主要由Regeneron公司和kymab公司所擁有。Regeneron公司專(zhuān)利(US8502018，EP1360287，CN105861548A)的主要技術(shù)點(diǎn)是在小鼠免疫球蛋白C區(qū)前用人免疫球蛋白V(D)J基因原位替換小鼠的免疫球蛋白V(D)J基因[25-27]；而kymab公司專(zhuān)利(EP2604110，CN102638971B)的主要技術(shù)點(diǎn)是在小鼠免疫球蛋白C區(qū)原位插入人免疫球蛋白V(D)J基因，同時(shí)讓小鼠的免疫球蛋白V(D)J區(qū)進(jìn)行翻轉(zhuǎn)，讓其無(wú)法進(jìn)行V-D-J-C區(qū)基因重排形成小鼠的抗體[28-29]。二者相同之處是在小鼠免疫球蛋白C區(qū)原位插入人免疫球蛋白V(D)J基因，區(qū)別在于KyMouseTM小鼠保留了自身的V(D)J基因，由于V(D)J區(qū)基因內(nèi)尚有很多未知的基因和功能，因此保留小鼠的V(D)J區(qū)基因，可能具有更好的效果。

3.4 人源抗體轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖相關(guān)的ADAM6專(zhuān)利

小鼠ADAM6基因位于免疫球蛋白重鏈基因的VH和DH之間，由兩個(gè)亞基組成(ADMM6 α和ADAM6 β)；它的主要功能之一與小鼠精子的游動(dòng)能力有關(guān)。雖然在人的免疫球蛋白基因中有相似ADAM6基因的存在，但它不編碼功能性蛋白質(zhì)。因此在采用原位替換小鼠V(D)J基因的同時(shí)(圖2)，會(huì)將小鼠的ADAM6基因連同V(D)J基因一起刪除，造成該品系小鼠的繁殖障礙。需要補(bǔ)充ADAM6基因才能恢復(fù)繁殖力，而補(bǔ)充ADAM6的專(zhuān)利為Regeneron公司擁有(US8697940B2、EP2738258B1、CN105861548A)[27,30-31]。

圖2 免疫球蛋白基因原位替換和ADAM6位置示意圖Figure 2 IgH heavy chain homologous replacement strategy andthe location of ADAM6 gene

3.5 人源抗體轉(zhuǎn)基因小鼠B細(xì)胞正常發(fā)育且一次性產(chǎn)生人IgG的專(zhuān)利

人免疫球蛋白V(D)J基因原位替換小鼠的免疫球蛋白V(D)J基因的技術(shù)雖然能保障B細(xì)胞正常發(fā)育，但其產(chǎn)生的抗體V區(qū)為人，C區(qū)是鼠的嵌合抗體，需要進(jìn)行C區(qū)置換才能獲得全人抗體。重慶金邁博公司的專(zhuān)利技術(shù)(CN105441455A)可使人源抗體轉(zhuǎn)基因小鼠在BCR階段使用小鼠免疫球蛋白C區(qū)基因，形成正常的BCR信號(hào)，保障B細(xì)胞正常發(fā)育，而在漿細(xì)胞階段，通過(guò)類(lèi)型轉(zhuǎn)換形成全人IgG，是目前國(guó)際上唯一一個(gè)既能保障B細(xì)胞正常發(fā)育，又可一次性獲得全人抗體的人源抗體轉(zhuǎn)基因小鼠[12]。

4 結(jié)語(yǔ)

人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)盡管在抗體開(kāi)發(fā)中得到了廣泛的應(yīng)用，但由于技術(shù)的復(fù)雜性，以及專(zhuān)利保護(hù)的原因，目前只有少數(shù)單位掌握這一核心工具動(dòng)物，且利用這一平臺(tái)保持其抗體開(kāi)發(fā)的優(yōu)勢(shì)地位。

人免疫球蛋白基因的序列都在MB以上，結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，且至今還有部分序列，特別是在V-、D-和J-基因選擇、重組和突變等方面的功能都不清楚。有的平臺(tái)選擇將修飾后的V-基因片段(人工V基因)連接在一起，這將影響V(D)J的利用率和突變等。最理想的人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)是將轉(zhuǎn)入人重鏈和兩個(gè)輕鏈V(D)J的基因組序列(authentic genomic DNA)，完全利用動(dòng)物體內(nèi)B細(xì)胞發(fā)育和抗體發(fā)生機(jī)制，獲得治療性抗體。由于許多制藥公司沒(méi)有自己的抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，需要利用其他(包括CRO)公司的人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)獲得治療性抗體的源頭序列，因此他們也需要從技術(shù)和專(zhuān)利的角度詳細(xì)分析選擇合適的人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)，一方面提高獲得候選抗體的概率，同時(shí)也要避免后續(xù)的知識(shí)產(chǎn)權(quán)糾紛。

2020年初以來(lái)，多家抗體制藥公司主要致力于研發(fā)新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的治療性中和抗體。Regeneron和鉑醫(yī)藥等公司利用人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)研發(fā)新型冠狀病毒肺炎的治療性抗體，其他公司如Pfizer和君實(shí)生物等利用感染病人的淋巴細(xì)胞分離中和性抗體。其中Regeneron公司的兩個(gè)組合抗體最先獲得FDA的緊急使用授權(quán)[32]。人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)的優(yōu)點(diǎn)是可以重復(fù)加強(qiáng)免疫，快速獲得針對(duì)病毒產(chǎn)生的親和力高和多樣性豐富的中和性抗體。但已有的人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)以小動(dòng)物為主，而在突發(fā)性生物安全事件發(fā)生時(shí)，需要快速大量產(chǎn)生特異性多克隆抗體進(jìn)行應(yīng)急防控，因此培育人源抗體轉(zhuǎn)基因大動(dòng)物，并建立一定規(guī)模的群體，將是未來(lái)突發(fā)性生物安全事件防控的重要發(fā)展方向。