范玲玲， 沈國民

(1.河南科技大學 基礎醫(yī)學院，洛陽 471000；2.河南省血栓與止血國際聯(lián)合實驗室，洛陽 471000)

2012年，美國科學家Alice Ting實驗室開發(fā)了一種稱為“鄰近標記”(proximity labeling，PL)的實驗方法，旨在研究在空間上相互分開的蛋白質(zhì)分子如何組裝成為功能完整的大分子復合物[1]。這種方法就是在活細胞中將目標蛋白和酶融合表達，酶催化小分子(通常是生物素)去共價標記目標蛋白鄰旁的蛋白質(zhì)[2-3]，這些蛋白經(jīng)細胞裂解被分離出來，通過質(zhì)譜分析進行鑒定[圖1(a)]。PL已被應用于探索新的細胞器成分[4-5]，并用于識別具有很高空間特異性的蛋白-蛋白相互作用伴侶[6-7]。研究表明，PL是一種具有納米級空間分辨率的分析分子相互作用和定位模式的方法[8]。

1 PL的原理及其應用

依據(jù)融合的酶不同，目前PL可分為兩類：基于過氧化物酶的PL和基于生物素連接酶的PL?；谶^氧化物酶的PL是在細胞或組織中融合表達工程化的抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APEX)[1，9]或辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)，用生物素-苯酚(biotin-phenol，BP)[3]或其變體[10-11]預處理細胞或組織，過氧化物酶將BP氧化成苯氧自由基，苯氧自由基與鄰旁的蛋白質(zhì)電子密度較高的側(cè)鏈發(fā)生反應[圖1(b)]，從而將生物素與鄰近蛋白共價連接。使用與固相載體相連的鏈霉親和素磁珠捕獲生物素標記的蛋白質(zhì)，并進行質(zhì)譜鑒定。Lam 等[9]通過A134P 的定向突變對APEX進行改進得到APEX2，APEX2 技術在催化效率和活性方面較 APEX 均有提升。因為過氧化物酶反應的快速動力學，所以這種方法可以用來研究動態(tài)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡。最近就有多項研究利用APEX融合G蛋白偶聯(lián)受體來探究配體刺激后不同時間點的蛋白相互作用組[12-13]。因為HRP/APEX在細胞固定后仍具有活性，可以氧化二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)而被 OsO4著色，所以HRP/APEX也可用于電子顯微鏡(EM)下固定細胞的造影劑，極大地推動了DAB 染色標記方法在電鏡成像中的應用，也使得研究人員在進行蛋白質(zhì)組學研究之前，可以先檢測過氧化物酶融合蛋白，以獲得其準確的亞細胞定位[1]。

(a)工程化的酶(綠色)與目標蛋白或在感興趣的亞細胞區(qū)域融合表達，將生物素(紅色)共價標記在鄰旁內(nèi)源性蛋白(灰色)上(細胞裂解后，生物素化蛋白被鏈霉親和素磁珠富集，酶切成肽，然后進行質(zhì)譜分析)；(b)對基于過氧化物酶APEX的PL，APEX將BP氧化為苯氧基，苯氧基繼而共價標記鄰近內(nèi)源性蛋白的富含電子側(cè)鏈的氨基酸殘基，如酪氨酸；(c)基于BioID的PL，外源性生物素與內(nèi)源性ATP配合使用，BioID將生物素轉(zhuǎn)化為活性的生物素化AMP從酶的活性位點釋放出來，與鄰近蛋白上的賴氨酸殘基發(fā)生反應使其被標記。

BioID是大腸桿菌生物素連接酶(BirA)的R118G突變體，用于融合生物素連接酶的PL。BirA以生物素和ATP作為底物來產(chǎn)生活性生物素-5′-AMP(bioAMP)中間體，然后將其轉(zhuǎn)移到細菌羧化酶蛋白的賴氨酸殘基上[圖1 (c)]。與基于過氧化物酶的PL相比，BioID的一個主要限制是：由于其反應動力學較慢，需要18～24 h的反應時間才能完成標記，從而妨礙了BioID用于動態(tài)過程的研究。此外，BioID體積較大(35 ku，而APEX為28 ku)，可能會比APEX獲得更多的錯誤靶標，增加假陽性率。近年來，一個小版本(27 ku)的BioID——BioID2已經(jīng)問世[14]。與BioID相比，BioID2具有許多優(yōu)點：提高了靶向融合蛋白的選擇性，減少了生物素的需要量，提高了鄰近蛋白的標記效率。最近，又改造出兩個更新版本的生物素連接酶：TurboID和miniTurbo，可以更高效地完成標記[15]。隨著PL技術發(fā)展，新的連接酶不斷出現(xiàn)。Ramanathan等[16]在研究 RNA 與蛋白互作時，從枯草芽孢桿菌中設計出一種衍生的新型BirA類似物BASU(BirA*, 來自Bacillussubtilis)，其動力學比BioID快3個數(shù)量級，且顯示出較高的信噪比。

結合文獻報道以及本人在臨近標記技術實際應用中得到的經(jīng)驗，總結如下。(1)融合表達BioID或APEX存在目的蛋白定位不正確的情況，造成假陽性結果，因此，需要設計合理的陽性或陰性對照，以剔除與目的蛋白空間距離上鄰近但非相互作用的蛋白。(2)APEX催化反應依賴于血紅素，所以在血紅素缺乏的環(huán)境中需補充血紅素來輔助APEX發(fā)揮其催化功能。(3)鄰近標記反應中，如果蛋白質(zhì)缺少暴露在表面的可以被生物素標記的氨基酸，或者某些蛋白被包裹在大的分子復合體中，會導致鄰近標記實驗失敗，間接產(chǎn)生假陰性結果。(4)如果目的蛋白定位信息不明確，直接使用鄰近標記方法，尤其是基于APEX 的技術是有風險的。隨著今后對現(xiàn)有鄰近標記技術局限性不斷改進和發(fā)展，該技術的應用前景將更加巨大。

2 PL在神經(jīng)生物學中的應用

長期以來，盡管大家一直對如何確定神經(jīng)元之間調(diào)節(jié)信息傳遞的分子成分很感興趣，但由于神經(jīng)組織在空間和時間維度上的復雜性和異質(zhì)性，對許多突觸亞區(qū)的分子成分進行生化純化一直是一個棘手的問題。近年來的研究表明，PL技術在闡明突觸間隙以及抑制性突觸后致密區(qū)(inhibitory postsynaptic density，iPSD)的分子組成方面具有重要應用價值。

Loh等[10]在離體培養(yǎng)的神經(jīng)元中使用基于HRP的PL鑒定了興奮性和抑制性突觸間隙的蛋白質(zhì)組(這是生化純化幾乎不可能完成的)，結果分別發(fā)現(xiàn)199 種和42種相關的蛋白質(zhì)，并確定其中糖基磷脂酰肌醇錨蛋白Mdga2作為一個潛在的特異性因子影響抑制性突觸的突觸前神經(jīng)遞質(zhì)Neuroligin-2募集。另一研究用同樣方法在培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元中，鑒定出新的興奮性突觸間隙候選蛋白，篩選并成功驗證受體酪氨酸蛋白磷酸酶ζ[17]。這些研究說明過氧化物酶介導的PL在鑒定突觸間隙蛋白組學方面的強大適用性，有助于闡明在正常和疾病狀態(tài)下突觸異質(zhì)性的變化。

采用類似的方法，Chung等[7]利用APEX標記技術獲得了離體培養(yǎng)神經(jīng)元的α-突觸核蛋白相互作用組。α-突觸核蛋白是神經(jīng)元富含的蛋白質(zhì)，參與突觸囊泡的形成和轉(zhuǎn)運，但它在神經(jīng)元中的異常聚集是引起某些神經(jīng)疾病如阿爾茨海默癥、帕金森病的關鍵因子[18-19]。通過APEX標記方法鑒定到與α-突觸核蛋白相關的225個蛋白，其中不僅包括內(nèi)吞及囊泡轉(zhuǎn)運相關蛋白，也包括很多mRNA結合蛋白以及蛋白合成的相關蛋白，在全細胞水平上系統(tǒng)揭示了α-突觸核蛋白在神經(jīng)細胞中的異常聚集可能是由多種因素造成的[7]。

在活體動物的腦組織中，iPSD是目前唯一通過PL技術研究的亞細胞結構[20]，因為標記探針的遞送和標記步驟與體外培養(yǎng)的細胞大不相同。BioID在活體小鼠大腦中的應用是PL在神經(jīng)生物學領域研究中的一個里程碑，為了在體內(nèi)表達BioID融合蛋白，研究人員將編碼生物素連接酶融合蛋白的腺病毒注射到新生小鼠的大腦皮層和海馬中，為了達到最大數(shù)量的突觸標記，盡可能優(yōu)化精確的病毒注射時間、生物素劑量和標記時間。生物素進入小鼠大腦比進入離體培養(yǎng)的細胞更具挑戰(zhàn)性，他們選擇腹腔注射生物素，因為生物素可以穿透各類組織，包括血腦屏障。該研究鑒定并驗證了iPSD的許多以前未知的成分，包括抑制性突觸后蛋白(inhibitory synaptic proteins，InSyn)1和InSyn2，敲除InSyn1導致突觸后抑制性位點減少，抑制性微電流頻率降低，增加了海馬的興奮性，這一研究凸顯了PL在新興神經(jīng)生物學研究中的巨大潛力。

此外，為了捕獲神經(jīng)組織中細胞類型特異性的細胞表面蛋白質(zhì)組，Li等[21]改良了Loh等離體培養(yǎng)神經(jīng)元的PL過程，利用HRP介導的PL對果蠅腦細胞表面蛋白質(zhì)組進行分析，優(yōu)化標記物遞送方式、原位生物素反應和組織樣品處理，發(fā)現(xiàn)了20 個調(diào)節(jié)神經(jīng)環(huán)路形成的細胞表面分子，其中，許多以前認為與神經(jīng)發(fā)育無關的進化保守蛋白家族。由于酶的快速動力學，這種基于HRP的PL反應只需幾分鐘就能完成，提供了具有高時間分辨率的細胞表面相關蛋白質(zhì)組，并最大限度地減低了H2O2的潛在毒性。這些發(fā)現(xiàn)說明PL技術的高時間分辨率在發(fā)現(xiàn)腦環(huán)路背后的分子機制方面有明顯優(yōu)勢。Menon等[22]采用BioID識別發(fā)育中的皮質(zhì)神經(jīng)元的E3泛素連接酶TRIM9和TRIM67蛋白-蛋白鄰近網(wǎng)絡，確定神經(jīng)元TRIM相互作用伙伴。驗證了一系列候選蛋白，包括細胞骨架調(diào)節(jié)蛋白、胞漿蛋白轉(zhuǎn)運蛋白、胞外和胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白，以及突觸調(diào)控蛋白。以此為基礎，未來可能會發(fā)現(xiàn)TRIM9和TRIM67調(diào)控神經(jīng)元形態(tài)和功能的新蛋白和機制。為了鑒定人類原鈣黏蛋白19(protocadherin 19，PCDH19)功能的蛋白復合物，研究者構建了Pcdh19-BioID融合蛋白，利用PL技術鑒定其鄰近蛋白。結果表明，PCDH19相互作用組富含調(diào)控Rho家族GTPases的蛋白、微管結合蛋白和調(diào)控細胞分裂的蛋白[23]，為未來研究PCDH19這種對神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育至關重要的蛋白的細胞和分子生物學提供了重要基礎。

3 PL應用所面臨的挑戰(zhàn)

3.1 PL在體應用需要將探針送入組織

由于PL技術需要同時向細胞遞送兩種物質(zhì)：編碼酶的DNA和小分子底物，因此在體內(nèi)進行PL時，一個需要考慮的因素是如何將底物分子遞送到目標器官或組織。在上述的iPSD研究中是通過腹腔注射生物素進入大腦[20]。哺乳動物自身不合成生物素，但生物素是脂肪酸生物合成所必需的維生素。低濃度(< 5 μmol/L)生物素進入細胞主要是通過Na+依賴的多種維生素轉(zhuǎn)運體1(Na+- dependent multivitamin transporter，SMVT1)介導的，SMVT1在腸、肝、腦、心、肺、腎等組織中廣泛表達，當生物素濃度超過25 μmol/L時，就會發(fā)生被動擴散[24]。利用這些途徑，BioID標記所需的生物素原則上可以通過食物供應。然而，不同動物的攝食行為有所不同，這種遞送方式可能會導致動物個體之間標記的顯著差異。iPSD的研究采用每日腹腔注射外源性生物素，為控制生物素用量提供了一種簡便有效的方法。此外，另一個體內(nèi)BioID標記的實驗中，研究人員把表達BioID的腫瘤細胞注射到小鼠體內(nèi)，再通過腹腔注射提供外源生物素，在腫瘤異種移植模型中研究c-MYC相互作用的分子伴侶[25]。

有研究人員選擇基于過氧化物酶的在體PL，以便更好地控制標記時間?；贏PEX的PL體內(nèi)底物遞送比BioID難度更大，但最近已經(jīng)有成功的例子[26-28]。在昆蟲和蠕蟲體表有一層緊密的疏水角質(zhì)層起著保護層的作用，對環(huán)境中的小分子高度不滲透，最近兩項將APEX蛋白質(zhì)組學應用于活體秀麗線蟲(C.elegans)腸道的研究，使用RNAi敲除一種糖基轉(zhuǎn)移酶基因bus-8，以破壞表皮完整性，并使BP和H2O2能夠遞送到蠕蟲體內(nèi)[26-27]。另一種方法是將目標組織從完整的動物體內(nèi)分離出來，如用APEX研究果蠅(Drosophila)肌肉細胞線粒體基質(zhì)的蛋白質(zhì)組[28]，就是在適當?shù)慕M織培養(yǎng)基中分離目標組織并進行鄰近標記，使組織在H2O2作用的短時間內(nèi)維持在生理環(huán)境中，為活體組織實施高時間分辨率的鄰近標記提供了一種可推廣的策略。

雖然H2O2在APEX的 PL反應中濃度較低(1 mmol/L)，且作用的時間很短(<1 min)，但H2O2有可能導致氧化應激從而引起細胞毒性[29]。因此，將H2O2標記限制在低濃度和短時間窗內(nèi)對最小化副作用至關重要。對體積極小的組織，H2O2可以像在離體培養(yǎng)的細胞中一樣，在整個樣品中迅速滲透和反應[26-28]。目前的腦片電生理學研究，在人工腦脊液中急性制備腦片的方法，可以考慮用于脊椎動物腦組織PL樣品，可有效縮短腦組織在H2O2中的孵育時間，從而減輕其毒性作用。

3.2 在體實驗需要克服高背景

在體應用PL的另一個挑戰(zhàn)是組織比離體培養(yǎng)的細胞含有更多的背景物質(zhì)。背景可能有兩個來源：一是組織中某些成分與鏈霉親和素的非特異性結合，二是內(nèi)源性生物素化蛋白。如果只是轉(zhuǎn)染生物體或某個組織中的一小部分細胞，或者當目標蛋白質(zhì)組非常小且分布比較局限時，就會出現(xiàn)前一個問題，這樣，生物素化(期望的)蛋白質(zhì)與非生物素化(不期望的)蛋白質(zhì)的比例很小，要想純化生物素化蛋白很難。為了解決這個問題，在親和純化之前對樣品進行粗分餾可能有助于提高生物素化蛋白與背景的比例。

在處理少量細胞或某個局部蛋白質(zhì)組時，另一個背景來源——內(nèi)源性生物素化蛋白也是必須關注的問題。例如，在果蠅的大腦中，內(nèi)源性生物素化蛋白非常豐富，尤其是在膠質(zhì)細胞中，這些內(nèi)源性生物素化的蛋白量可能大大超過了BioID或APEX生物素化蛋白的量，并競爭性地與鏈霉親和素磁珠結合。在這些研究中，分餾或分離可能有助于去除不相關的背景。所以，未來開發(fā)非生物素標記的富集蛋白質(zhì)組的研究方法將有很大意義。以Rhee等[3]為例，他們已經(jīng)證明APEX可以用烷基苯酚而不是生物素苯酚來標記蛋白質(zhì)，烷基可以與各種疊氮化物試劑結合，富集蛋白就可以不再使用鏈霉親和素磁珠。

另外，組織中還有一些其他背景來源，對基于過氧化物酶的PL，內(nèi)源性過氧化物酶的活性也可以產(chǎn)生背景，例如，在秀麗線蟲的腸道中，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性過氧化物酶活性高于正常培養(yǎng)細胞[27]。因此，設計標記或未轉(zhuǎn)染對照組對減少來自非特異性結合物、內(nèi)源性生物素化蛋白和內(nèi)源性過氧化物酶活性的干擾尤其重要。減少組織中背景的另一個策略是增加目的信號，比如，可以延長反應時間來標記更多物質(zhì)?；谶^氧化物酶的PL，有時信號低是因為過氧化氫酶高表達，過氧化氫酶可以抑制H2O2，或者因為過氧化物酶輔因子血紅素過低，可以通過添加血紅素來改善。

4 鄰近標記在神經(jīng)生物學中的應用前景

4.1 特定時空條件下相互作用蛋白質(zhì)組鑒定

在過去幾年里，蛋白質(zhì)組學結合生物化學方法(如分餾法、免疫沉淀法和化學交聯(lián)法)已經(jīng)在鑒定許多神經(jīng)結構如突觸末梢、突觸小泡、PSD和活性區(qū)的分子組成方面發(fā)揮重要作用。先進的成像方法，如陣列斷層掃描，也為神經(jīng)生物學家提供了大腦分子結構的高分辨率地圖，然而，陣列斷層掃描一次只能掃描20個靶點，而且可用的抗體也很有限，同時基于生化純化的蛋白質(zhì)組學假陽性率高，細胞內(nèi)污染物如線粒體和核蛋白，大概占突觸小體鑒定成分的20%～40%[30]。而PL這種高分辨率的鑒定時空特異性相互作用蛋白的方法極大地彌補了現(xiàn)有技術的不足。

4.2 亞細胞結構蛋白質(zhì)組鑒定

除了已經(jīng)利用PL蛋白組學鑒定的亞細胞結構分子組成外，神經(jīng)元還具有許多功能專一的亞細胞結構，例如：發(fā)出軸突的軸丘[31]，以及在某些細胞類型中執(zhí)行獨特功能的高度特異性的結構。電生理及結構研究表明，作為哺乳動物聽覺的主要機械傳感器——毛細胞的纖毛尖端具有獨特的機械電轉(zhuǎn)換機制，目前其分子特性未知[33]，所以基于PL的蛋白質(zhì)組學分析為系統(tǒng)地鑒定這些功能特殊區(qū)域的蛋白質(zhì)分子組成提供了前所未有的機會。越來越多的證據(jù)表明，神經(jīng)膠質(zhì)細胞不僅是支持細胞，還廣泛參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能[34]。神經(jīng)膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元連接處的蛋白質(zhì)組學圖譜將幫助進一步了解神經(jīng)膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元相互作用的分子基礎。另外，神經(jīng)膠質(zhì)細胞的致病機理涉及許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默病等[35]。在正常和病理條件下，不同類型膠質(zhì)細胞中不同區(qū)域(如內(nèi)涵體、溶酶體、線粒體、細胞表面)的基于PL的蛋白質(zhì)組學研究，可以為深入了解膠質(zhì)細胞在這些疾病中的作用提供有效手段。

探究高度復雜的動態(tài)相互作用的蛋白質(zhì)組將為進一步了解神經(jīng)生物學中的關鍵分子提供途徑。雖然已經(jīng)通過基因分析鑒定出大量對神經(jīng)發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導至關重要的分子[36]，但大多數(shù)仍然是“孤兒”基因，我們對其相互作用的分子伴侶和功能都知之甚少。將基于PL的蛋白質(zhì)組學進行這些分子的研究，可以捕獲穩(wěn)定的或瞬時的分子伴侶，并獲得一個全面的分子相互作用網(wǎng)絡。正如GPCR通路所展示的那樣[12-13]，高時間分辨率的過氧化物酶PL能夠鑒定在不同條件下的動態(tài)相互作用蛋白質(zhì)組，這些蛋白質(zhì)分子中有許多與人類疾病有關[37]，系統(tǒng)地分析病理條件下的分子伴侶不僅有助于闡明病理機制，還有可能發(fā)現(xiàn)新的疾病相關基因。

鑒于BASU在檢測活細胞中的 RNA-蛋白質(zhì)相互作用比其他PL方法更有優(yōu)勢[38]，BASU已成為研究 RNA-蛋白互作的有力補充[39]，在神經(jīng)生物學領域，也將為深入解析 RNA 的重要生物學功能提供強有力的手段。