左 群， 呂育財， 宋婷薇， 郭金玲， 任立偉， 龔大春

(1. 湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心(三峽大學(xué))，宜昌 443002；2. 中國輕工業(yè)功能酵母重點實驗室(三峽大學(xué))，宜昌 443002； 3. 三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院，宜昌 443002)

鉻鹽、皮革、印染以及電鍍等涉及鉻工業(yè)的發(fā)展造成土壤鉻污染的事件逐漸增多，鉻環(huán)境污染也越來越嚴(yán)重，逐漸威脅到人類的健康。Cr(VI)易溶于水，氧化性強(qiáng)，被列入致癌物質(zhì)[1]，人體長期暴露于鉻污染環(huán)境會引起神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、腎臟等損害，皮膚接觸可能導(dǎo)致過敏或遺傳性基因缺陷[2]，而Cr(VI)對環(huán)境也具有持久性的危害。Cr(III)溶解性小，移動性弱，是人體和動物體所必需的微量元素，主要參與糖和脂肪的代謝過程[3]。

微生物法為鉻(VI)污染土壤及工業(yè)含鉻(VI)廢水的處理開辟了一個極具潛力的新領(lǐng)域。微生物能不斷地生長繁殖，具有很強(qiáng)的適應(yīng)環(huán)境能力，且用微生物處理鉻污染具有投資成本低、能耗小、無二次污染等特點。目前很多能夠修復(fù)Cr(VI)污染的微生物被分離得到。包括Pseudomonasmandelii[4]、Bacilluspumilus[5]、Cellulosimicrobiumcellilans[6]、Sulfatereducingbacteria[7]、Desulfovibriodesulfuricans[8]、Morganellamorganii[9]等。微生物將Cr(VI)還原為Cr(III)，其修復(fù)方式主要是NADH作為還原劑的細(xì)菌酶系統(tǒng)，將Cr(VI)轉(zhuǎn)化為可溶性NAD+-Cr(III)絡(luò)合物[10]。然而，Cr(VI)對微生物有毒害作用，很多微生物在高濃度的Cr(VI)環(huán)境中無法有效還原鉻或生長，因此，從環(huán)境中分離或通過基因工程手段獲取高性能Cr(VI)還原菌株仍是重金屬生物修復(fù)領(lǐng)域的重要課題。本研究以獲得有效Cr(VI)還原菌株為目標(biāo)，從求索溪底泥中，分離到一株Cr(VI)還原菌，并對該菌的底物利用特征、最適還原條件及Cr(VI)還原能力進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 Ylb10菌的分離和培養(yǎng)基

YEM001(富集于三峽大學(xué)求索溪底泥)是一組有效還原Cr(VI)的菌群，由多種細(xì)菌組成，其中包括Cr(VI)還原細(xì)菌和非Cr(VI)還原細(xì)菌。以YEM001為菌源，利用梯度稀釋涂布平板法分離Cr(VI)還原菌株，并經(jīng)純化分離，最終獲得具有Cr(VI)能力的純培養(yǎng)菌株Ylb10。分離和培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為PCS-Cr培養(yǎng)基，主要成分：蛋白胨5 g/L，酵母浸粉1 g/L，氯化鈉5 g/L, pH 8.5～9.0，K2Cr2O7100 mg/L。菌株培養(yǎng)于28 ℃生化培養(yǎng)箱。固體培養(yǎng)基則加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂粉(索萊寶，北京)。

1.2 方法

1.2.1 Cr(Ⅵ)的測定

采用二苯碳酰二肼分光光度法[11]。

1.2.2 Cr(Ⅵ)還原率計算

Cr(VI)還原率公式：R=(1-Cf/Ci)×100%

式中：R為Cr(VI)的還原率，%；Ci為Cr(VI)初始濃度，mg/L；Cf為處理一定時間后Cr(VI)的實測濃度，mg/L。

1.2.3 Ylb10菌的16S rDNA測序鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

將Ylb10菌培養(yǎng)48 h左右，收集3OD菌體量，使用TaKaRaMiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(寶生物，大連)提取細(xì)菌總DNA，所獲DNA進(jìn)行16S rDNA PCR。引物：27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。50 μL的反應(yīng)體系：PremixTaq25 μL，27F 2 μL，1492R 2 μL，DNA 10 μL，無菌水11 μL。PCR條件：95 ℃ 預(yù)變性10 min，1個循環(huán)；94 ℃ 變性30 s, 55 ℃ 退火30 s, 72 ℃ 延伸1 min, 30個循環(huán)；72 ℃ 再延伸5 min，1個循環(huán)。

PCR產(chǎn)物使用Fast Pure Gel DNA Extraction Mini kit DC301 03/04(諾唯贊，南京)進(jìn)行產(chǎn)物回收?；厥蘸蟮漠a(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。將細(xì)菌的16S rDNA測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的16S rDNA序列進(jìn)行比對，并利用MEGA X進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

1.2.4 Ylb10菌生長曲線的測定

將Ylb10菌接入無鉻的PCS培養(yǎng)基中，pH 8.0，定時檢測菌體OD600，并設(shè)置無菌的空白。

1.2.5 Ylb10菌底物利用分析

利用Biolog的GEN Ⅲ鑒定板，分析Ylb10菌利用的底物。用TSA培養(yǎng)基，活化Ylb10菌，使用Inoculatorz棉簽在瓊脂平板中有細(xì)胞生長的地方沾取直徑3 mm的菌落，加入IF-A接種液中，使細(xì)胞濃度為90%～98%T。將菌懸液按每孔100 μL的量加入GEN Ⅲ鑒定板的所有孔中并蓋好，將接種Ylb10菌的GEN Ⅲ鑒定板置于33 ℃培養(yǎng)箱孵育，定時檢測GEN Ⅲ鑒定板中底物變化情況。

1.2.6 Ylb10菌Cr(Ⅵ)還原性質(zhì)實驗

(1)氧氣對Ylb10還原Cr(VI)的影響。將在固體培養(yǎng)基上的Ylb10菌，挑至液體PCS培養(yǎng)基[含100 mg/L的Cr(VI)]，置于28 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)3 d， 8 000 r/min離心5 min，收集菌體，接種于新鮮PCS-Cr培養(yǎng)基，Cr(VI)濃度為100 mg/L，分別在搖床(200 r/min)和靜置條件下培養(yǎng)，溫度均為28 ℃，每組設(shè)置3個重復(fù)，定時檢測OD600以及Cr(VI)含量變化。

(2)不同起始pH值對Ylb10還原Cr(VI)的影響。將Ylb10菌分別接種于pH 5、6、7、8和9共5個pH值梯度的PCS-Cr[100 mg/L Cr(VI)]培養(yǎng)基中，定時檢測樣品中的pH值，Cr(VI)濃度及OD600。

(3)不同Cr(Ⅵ)濃度對Ylb10還原Cr(VI)的影響。將Ylb10菌分別接種于含有0、50、100、200和300 mg/L K2Cr2O7的PCS培養(yǎng)液中，其起始培養(yǎng)OD600為0.2，定時檢測樣品中的Cr(VI)濃度及OD600。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ylb10菌的分離和鑒定

Ylb10菌株分離于Cr(VI)還原菌群YEM001，再連續(xù)在含Cr(VI)的定向富集下，獲得較好的Cr(VI)還原能力。分離的Ylb10菌能夠生長于含Cr(VI)的PCS培養(yǎng)基。菌落透明，圓形，偏小見圖1(a)，革蘭氏陰性菌見圖1(b)。

圖1 Ylb10菌在含鉻的PCS培養(yǎng)基上的生長形態(tài)(a)和Ylb10菌的革蘭氏染色(b)

Ylb10菌株的16S rDNA基因被測序(上海生工)，所獲的序列提交到NCBI網(wǎng)站(GenBank MT678829)，用BLAST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)樹(圖2)。結(jié)果顯示，Ylb10菌與Alicycliphilusdenitrificans的16S rDNA相似率為98.07%。Alicycliphilus菌株能夠降解某些污染物，如丙酮、環(huán)己醇和N-甲基吡咯烷酮，苯，甲苯和蒽，以及聚氨酯清漆和泡沫，它們還可以將Cr(VI)轉(zhuǎn)化至Cr(III)[12]。

圖2 基于Ylb10菌16S rDNA測序的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 Ylb10菌株利用底物的分析

33 ℃孵育24 h后，測定GEN III 鑒定板底物的利用情況(表1)。Ylb10主要利用的底物有丙酮酸甲酯、α-羥基-丁酸、L-乳酸、α-酮-丁酸、丙酸、乙酸、β-羥基-D,L丁酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-絲氨酸等，而對葡萄糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、糊精和甘露糖等多種糖都未表現(xiàn)出代謝能力。AlicycliphilusdenitrifificansK601T可以利用一元羧酸(C2-C7)、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、乳酸、丙酮酸和富馬酸等[13]。小分子有機(jī)酸對Cr(VI)還原有一定影響，如在還原態(tài)綠脫石-有機(jī)酸-六價鉻共存的體系中，酒石酸和蘋果酸等會促進(jìn)綠脫石中結(jié)構(gòu)亞鐵還原Cr(VI)，含有α-羥基/羰基的有機(jī)酸，可提供電子來還原Cr(VI)[14]。Ylb10對Cr(VI)的還原能力，可能與有機(jī)酸的利用有關(guān)。

表1 菌株 Ylb10 Gen III 鑒定板反應(yīng)結(jié)果

2.3 Ylb10菌的生長特性

Ylb10菌在無鉻的PCS培養(yǎng)基中的生長趨勢見圖3。當(dāng)以0.15 OD600接種于新鮮PCS培養(yǎng)液中，菌株在很短時間內(nèi)開始復(fù)蘇生長，并在40 h內(nèi)結(jié)束指數(shù)生長期，進(jìn)入生長的穩(wěn)定期，87 h進(jìn)入衰亡期。表明該菌具有較快生長能力，這對處理環(huán)境污染物是有利的。

圖3 Ylb10菌無鉻條件下生長曲線

2.4 Ylb10菌還原Cr(Ⅵ)的能力

2.4.1 氧氣對Ylb10還原Cr(VI)的影響

比較Ylb10在不同氧含量條件下生物量(OD600)和還原Cr(VI)的效率(圖4)。結(jié)果顯示：Ylb10在搖床條件下的生物量顯著高于靜置培養(yǎng)，充足的氧氣更有利Ylb10的生長，見圖4(a)。與生物量趨勢相反，Ylb10在搖床條件下，Cr(VI)還原能力非常弱，72 h將100 mg/L 的Cr(VI)還原18.24%，而靜置培養(yǎng)36 h還原98.70%，見圖4(b)?？梢?，氧氣對Ylb10還原Cr(VI)具有抑制作用。Cr(VI)還原可以分為酶還原和非酶還原，酶還原發(fā)生在厭氧或好氧條件下，Ylb10菌在厭氧條件下還原Cr(VI)，這可能與鉻酸鹽作為電子受體的膜還原酶有關(guān)[15]，而厭氧條件還原Cr(VI)，在實際應(yīng)用Cr(VI)污染的水和土壤時，也更有優(yōu)勢。

圖4 Ylb10菌在靜置與搖床培養(yǎng)條件下對六價鉻還原對比

2.4.2 不同起始pH值對Ylb10還原Cr(VI)的影響

pH對Ylb10生長和還原Cr(VI)的能力具有明顯影響。Ylb10最適生長的pH值為7。而當(dāng)pH值低于6，菌株的生長嚴(yán)重受到抑制，見圖5(a)。在培養(yǎng)過程中，菌株的生長影響培養(yǎng)液的pH值，最終pH值趨向于8～9，見圖5(b)。表明培養(yǎng)液具有代謝酸的能力，這與GEN III鑒定板檢測結(jié)果相對應(yīng)。

環(huán)境的pH值也影響Ylb10對Cr(VI)的還原效率。當(dāng)培養(yǎng)液pH值為5、6時，Ylb10未表現(xiàn)出Cr(VI)的還原能力；當(dāng)pH值為7、8、9時均表現(xiàn)出還原Cr(VI)的能力；且當(dāng)pH值為8和9時，Ylb10還原Cr(VI)的效率最高，36 h還原Cr(VI)的效率分別為98.47%和95.54%，而當(dāng)pH值為7時，48 h能還原94.78%[圖5(c)]。由此可見，Ylb10菌株六價鉻還原最適的pH值范圍為8～9。弱堿性條件下，更有利于Ylb10菌還原Cr(VI)，結(jié)果與報道的基本一致[16-17]。嗜堿菌體內(nèi)pH值在7～9時，細(xì)胞膜上的Na+/H+反向運(yùn)輸系統(tǒng)，可以將細(xì)胞質(zhì)的pH值維持在一定生理范圍內(nèi)[18]。

圖5 不同pH值條件下Ylb10菌OD600，六價鉻含量和pH變化

2.4.3 不同Cr(VI)濃度對Ylb10還原Cr(VI)的影響

Ylb10還原Cr(VI)能力結(jié)果見圖6。當(dāng)培養(yǎng)液中Cr(VI)的濃度為50 mg/L時，18 h Cr(VI)可以還原96.45%；Cr(VI)的濃度為100 mg/L時，24 h可以還原93.83%；200 mg/L時，60 h可以還原99.06%；300 mg/L時，96 h可以還原2.15%。全部還原所需要的時間隨著Cr(VI)濃度的升高而延長。當(dāng)培養(yǎng)液中Cr(VI)濃度達(dá)到300 mg/L時，該菌株無法還原Cr(VI)。李維宏等[19]分離出的一株Enterobacterhormaechei菌株，可以將200、400和800 mg/L的Cr(VI)分別還原85.6%、82.1%和58.2%。何元等[20]分離的Serratiasp.S2還原能力達(dá)到20 mg/L。Sanjay等[21]分離得到的KlebsiellapneumoniaeMS 1.5和MangrovibacteryixingensisMS 2.4能夠還原80 mg/L和100 mg/L的Cr(VI)。Banerjee等[22]分離的Pseudomonasbrenneri菌株在Cr(VI)濃度為60 mg/L時得到最大修復(fù)。Sarankumar等[23]分離出的BacilluscohniiSR2和BacilluslicheniformisSR3能25 h將550 mg/L的Cr(VI)分別還原82%和90%?？梢奩lb10菌與其他鉻還原菌株相比，較短時間具有較高的Cr(VI)還原能力。

圖6 不同六價鉻起始濃度Ylb10菌還原影響Figure 6 Effects of different hexavalent chromium initial concentrations on Ylb10 reduction ability

3 結(jié)論

(1)從YEM001菌群中成功分離得到一株Cr(VI)還原菌株Ylb10，經(jīng)鑒定為脫氮嗜脂環(huán)物菌(Alicycliphilusdenitrificans)，革蘭氏陰性菌。(2)Ylb10對氨基酸和有機(jī)酸有很好的利用。主要利用的底物有丙酮酸甲酯、α-羥基-丁酸、L-乳酸、β-羥基-D,L丁酸、丙酸、乙酸、α-酮-丁酸、L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸等，而對葡萄糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、糊精和麥芽糖等多種糖都未表現(xiàn)出代謝能力。(3)Ylb10靜置培養(yǎng)條件更有利于Cr(VI)的還原。搖床(好氧)條件Ylb10菌生物量生長迅速，但是難以還原Cr(VI)，72 h 100 mg/L的Cr(VI)僅還原18.24%。靜置培養(yǎng)條件下，36 h能將100 mg/L的Cr(VI)還原98.70%。(4)Ylb10對Cr(VI)有很高的還原能力。Ylb10菌最適生長pH值為7，最佳還原Cr(VI)的pH值為8～9。在Cr(VI)的濃度為50 mg/L時，18 h Cr(VI)可以還原96.45%；Cr(VI)的濃度為100 mg/L時，24 h可以還原93.83%；200 mg/L時，60 h可以還原99.06%。

結(jié)果表明，Ylb10菌具有較高Cr(VI)還原能力，有望應(yīng)用于鉻污染的水樣及土壤。